Este protocolo descreve técnicas que podem ser utilizadas por pequenos fisiologistas animais para elucidar o papel de neuropeptídeos e outros fatores hormonais que regulam o sistema digestivo e ou excretório. Essas técnicas permitem medições de amostras biológicas de micro porte que de outra forma não seriam possíveis usando técnicas projetadas especificamente para modelos animais maiores, incluindo, por exemplo, roedores e teleus. Este método pode fornecer uma visão da regulação endócrina do intestino, incluindo o transporte epitelial, bem como músculo liso associado ao trato gastrointestinal em insetos e em espécies não-insetos de tamanho semelhante.
Demonstrando os procedimentos tubais renais de insetos estará Farwa Sajadi, um doutorando do meu laboratório. Além disso, um ex-estudante de pós-graduação do meu laboratório Aryan Lajevardi estará demonstrando os protocolos focados em hindgut. Comece preparando o Ramsay e a contração ensaios pratos para os experimentos.
Use pipeta e encha poços com até 20 microliters de solução. Para controles não estimulados, preencha os poços com 20 microliters do meio de Aedes salino Schneider. Uma vez que todos os poços estejam cheios, despeje óleo mineral hidratado no prato de ensaio até que os poços e pinos minutien estejam submersos.
Depois de imergir o túbulo no poço, pegue a extremidade proximal do túbulo com fórceps, remova-a da gota de banho e enrole a extremidade em torno do pino. Enrole o túbulo ao redor do pino duas vezes mantendo o comprimento do túbulo permanecendo na gota de banho consistente com os outros túbulos. Para fazer uma microeletroroda seletiva de sódio, use uma seringa de um mililitro para enchimento do eletrodo com cloreto de sódio de 100 mililitros.
Certifique-se de que a solução de enchimento de enco tudo se encha até a ponta do eletrodo. Se aparecerem bolhas de ar, gire suavemente o microeletrodo ou remova a solução e reabasteça. Mergulhe uma ponta de pipeta de 10 microliter na solução de ionóforo seletivo de sódio.
Alinque o eletrodo perpendicular à pipeta, em seguida, coloque um dedo enluvado sobre a parte inferior da ponta para criar pressão e expulse uma pequena gota de ionóforo. Toque cuidadosamente a gota de ionophore para a ponta de microeletrídico, certificando-se de não quebrá-la. Encha um pequeno béquer no meio do caminho com 100 mililitros de sódio e coloque um pouco de argila modeladora no interior no topo do béquer.
Depois que o ionóforo tiver sido tomado, coloque a ponta de eletrodo na parede do béquer, deixando as pontas dentro do cloreto de sódio. Mantenha o ISME no béquer até que esteja pronto para uso. Para fazer o eletrodo de referência ISME, encha um eletrodo com cloreto de potássio de 500 milimilas e armazene-o em um béquer.
Cubra as pontas do eletrodo utilizando uma solução de aproximadamente 3,5% de cloreto de polivinil, dissolvido em tetrahidrofurano, para evitar o deslocamento do ionóforo quando submerso em óleo de parafina. Para calibrar o eletrodo de sódio, coloque 10 gotículas de microliter de concentrações padrão de cloreto de sódio na borda do prato Ramsey com os túbulos malpighianos incubados. Coloque as gotículas padrão a dois centímetros de distância com a maior concentração em cima.
Insira o eletrodo de referência e o eletrodo seletivo de íon sobre os fios de prata do cloreto e fixe-os com segurança usando suportes de eletrodos que estão ligados a micro manipuladores. Navegue pelos dois eletrodos em direção à gotícula de cloreto de sódio de 200 milimões usando os micro manipuladores, garantindo que as pontas eletro não toquem na parte inferior do prato. Ligue o eletrometro para iniciar a gravação e deixe a leitura estabilizar.
Grave a leitura e continue para o próximo padrão. Após a aquisição de medições da taxa de secreção de fluidos, mova cuidadosamente os eletrodos seletivos de referência e íon para a gotícula secreta usando os micro manipuladores. Ligue a gravação e deixe a leitura estabilizar e, em seguida, grave.
Ligue o Amplificador IPA-2 Ion/Polarographic, o microscópio de luz e os computadores. Coloque a microeletrídra seletiva de sódio em um suporte constituído por um fio de cloreto de prata e conecte-o na tomada do conector feminino. Remova um eletrodo de referência do béquer com o cloreto de potássio, colocando um dedo em uma extremidade e inclinando o capilar de vidro em direção a este dedo para evitar que o ágar caia.
Coloque cuidadosamente uma extremidade no suporte, garantindo que não se forme bolhas. Se houver uma bolha, remova o eletrodo de referência, rechee o suporte com três cloreto de potássio molar e repita. Coloque o suporte de eletrodo na tomada do conector feminino.
Após a calibração, disseca o órgão. Coloque o prato de poli-L-lysine com a amostra dissecada no estágio do microscópio e insira a ponta do eletrodo de referência dentro do soro fisiológico. Submergir a ponta do íon microeletrodo seletivo no soro fisiológico, tomando cuidado para não quebrar a ponta.
Use os botões de ajuste manual para ajustar a posição de microeletrídro enquanto olha sob o microscópio de luz. Ajuste a posição vertical do microeletrodo de tal forma que sua ponta esteja no mesmo plano que o órgão ou tecido, em seguida, gire o interruptor do motor para habilitar. Usando as teclas de seta do computador, mova o microeletrodo horizontalmente para uma posição de três milímetros de distância do tecido para medir gravações de fundo.
Quando estiver pronto, comece a gravar pressionando F5, obtenha cinco medições de atividade de fundo. Mova a ponta da microeletrídria para perto do tecido tomando cuidado para não perfurar o órgão. Reduza a sensibilidade do golpe da chave para colocar a ponta do microelerode dois micrômetros diretamente para a direita, perpendicular ao tecido.
Obtenha três gravações no local ao longo da almofada retal para identificar o local de maior atividade de íons e, em seguida, obter medições salinas de base no local exibindo maior atividade. Para registrar contrações de patas traseiras, encha um dos poços do prato com um volume conhecido de soro fisiológico do Aedes. Após a dissecação, transfira cuidadosamente o hindgut dissecado preso ao intestino médio em um poço em outro prato, certificando-se de não beliscar o íleo.
Submergir o intestino no soro fisiológico dentro do poço e coloque pinos minutien no intestino médio e reto. O íleo não deve estar sob tensão e as contrações espontâneas originárias da válvula pilórica no íleo anterior devem ser observadas. Conecte a câmera de vídeo ao microscópio estereoscópico.
Em seguida, coloque o prato contendo o órgão dissecado sob o microscópio e grave um vídeo por dois minutos. A aplicação de DH31 contra túbulos malpighianos não estimulados resulta em um aumento significativo na taxa de secreção de fluidos, confirmando seu papel como hormônio diurético em mosquitos Aedes. Quando os túbulos são tratados com AedaeCAPA-1, observa-se uma redução na taxa de secreção em túbulos malpighianos estimulados por DH31.
Eletrodos seletivos de íons foram usados para medir concentrações de sódio nas gotículas secretadas. O tratamento de DH31 nos TM não teve efeito na concentração de sódio na gotícula secretada. No entanto, com a aplicação do AedaeCAPA-1, a concentração de sódio no fluido secretado foi significativamente aumentada.
Além disso, em comparação com os controles não estimulados, o DH31 levou a uma taxa de transporte de sódio significativamente maior, enquanto o AedaeCAPA-1 aboliu esse aumento nos túbulos estimulados por DH31. O SIET foi utilizado para avaliar alterações no transporte de sódio ao longo da pítelia retal de mosquitos fêmeas adultas. Um analógico leucocina foi usado para examinar alterações na absorção de sódio, o que resultou em uma redução de quatro vezes na absorção de sódio em comparação com o controle salino.
Para avaliar o papel de um neuropeptídeo pirokinin2 na motilidade ileal, foi utilizado um análogo de Rodélio prolixus, que foi mostrado anteriormente para ativar o receptor A.aegypti PK2 enriquecido no íleo do mosquito. Em relação aos níveis de linha de base, o PK2 inibe significativamente as contrações ileais. Ao realizar um ensaio ramsay com túbulos malpighianos e medindo taxas de íon ou secreção de fluidos, é imperativo que os túbulos não sejam danificados durante a dissecção ou durante a transferência para o prato de ensaio.
Seguindo o ensaio de Ramsay, transportadores específicos de membrana podem ser direcionados farmacologicamente ou molecularmente usando técnicas genéticas reversas para discernir sua contribuição específica para o transporte transepitelio de solutos no epitélio simples.
