פרוטוקול זה מתאר טכניקות שניתן להשתמש בהן על ידי פיזיולוגים של בעלי חיים קטנים כדי להבהיר את תפקידם של נוירופפטידים וגורמים הורמונליים אחרים המווסתים את מערכת העיכול או ההפרשה. טכניקות אלה מאפשרות מדידות של דגימות ביולוגיות בגודל מיקרו שאחרת לא היו אפשריות באמצעות טכניקות שתוכננו במיוחד עבור מודלים גדולים יותר של בעלי חיים, כולל, למשל, מכרסמים ו teleus. שיטה זו יכולה לספק תובנה על הרגולציה האנדוקרינית של המעיים, כולל הובלת אפיתל, כמו גם שריר חלק הקשור למערכת העיכול בחרקים ובמינים שאינם חרקים בגודל דומה.
הדגמת נהלי חצוצרות החרקים תהיה פארווה סג'די, מועמדת לדוקטורט מהמעבדה שלי. בנוסף, סטודנט לתואר שני לשעבר מהמעבדה שלי ארית Lajevardi יהיה להפגין את הפרוטוקולים ממוקדים hindgut. התחילו בהכנת רמזי ובדיקות התכווצות כלים לניסויים.
יש להשתמש בפיפטה ולמלא בארות עם עד 20 מיקרוליטרים של תמיסה. לפקדים לא מגורים, מלאו את הבארות ב-20 מיקרוליטרים של המדיום של Aedes מלוחים שניידר. לאחר שכל הבארות מתמלאות, יוצקים שמן מינרלי מיובש לצלחת הבדיקה עד שהבארות וסיכות המינוטין שקועות.
לאחר טבילת הצינור בבאר, להרים את הקצה הפרוקסימלי של הצינור עם מלקחיים, להסיר אותו מן טיפת הרחצה, ולעטוף את הקצה סביב הסיכה. עוטפים את הצינור סביב הסיכה פעמיים ושומרים על אורך הצינור שנותר בטיפת הרחצה בקנה אחד עם הצינורות האחרים. כדי להפוך את microelectrode נתרן סלקטיבי, להשתמש מזרק מיליליטר אחד כדי למלא את האלקטרודה עם 100 מילימולרי נתרן כלורי.
ודאו שתמיסת המילוי האחורית מתמלאת עד קצה האלקטרודה. אם מופיעות בועות אוויר, יש להעיף בעדינות את המיקרואלקטרוניקה או להסיר את התמיסה ולמלא מחדש. יש לטבול קצה פיפטה של 10 מיקרוליטר בתמיסת היונופור הסלקטיבית של הנתרן.
בשורה את האלקטרודה מאונך לפיפטה, ולאחר מכן למקם אצבע בכפפה מעל החלק התחתון של הקצה כדי ליצור לחץ ולגרש טיפה קטנה של ionophore. בזהירות לגעת טיפה של ionophore לקצה microelectrode, הקפדה לא לשבור אותו. מלאו קטנה באמצע הדרך עם 100 מילימולר נתרן כלורי והניחו קצת חימר דוגמנות על החלק הפנימי בחלק העליון של הכוס.
לאחר היונופור נלקח, מניחים את קצה האלקטרודה על קיר הכוס, ומאפשרים את הטיפים בתוך הנתרן כלורי. שמור את ISME בכוס עד שיהיה מוכן לשימוש. כדי להפוך את אלקטרודת הייחוס ISME, למלא בחזרה אלקטרודה עם 500 מילימולר אשלגן כלורי ולאחסן אותו בכוס.
מצפים את קצות האלקטרודה באמצעות תמיסה של כ 3.5% פוליוויניל כלוריד, מומס טטרהידרופורן, כדי למנוע תזוזה של היונופור כאשר שקוע בשמן פרפין. כדי לכייל את אלקטרודת הנתרן, מניחים 10 טיפות מיקרוליטר של ריכוזים סטנדרטיים של נתרן כלורי על קצה צלחת רמזי עם הצינורות המלפיגיים המדודרים. מניחים את הטיפות הסטנדרטיות במרחק שני סנטימטרים זה מזה עם הריכוז הגבוה יותר למעלה.
הכנס הן את אלקטרודת הייחוס והן את האלקטרודה הסלקטיבית של היונים מעל חוטי הכסף של הכלוריד והידק אותם בבטחה באמצעות מחזיקי אלקטרודות המחוברים למיקרו מניפולטורים. נווט את שתי האלקטרודות לכיוון טיפת הנתרן כלורית 200 מילימולרית באמצעות מניפולטורים מיקרו, להבטיח כי קצות אלקטרו לא לגעת בתחתית המנה. הפעל את האלקטרומטר כדי להתחיל להקליט ולאפשר לקריאה להתייצב.
הקלט את הקריאה והמשיך לסטנדרט הבא. לאחר רכישת מדידות של קצב הפרשת הנוזלים, העבירו בזהירות את ההתייחסות ואת האלקטרודות הסלקטיביות של היונים לטיפות המופרשות באמצעות המניפולטורים הזעירים. הפעל את ההקלטה ואפשר לקריאה להתייצב ולאחר מכן הקלט.
הפעילו את מגבר ה-IPA-2 Ion/Polarographic, את מיקרוסקופ האור ואת המחשבים. מניחים את הנתרן מיקרואלקטרודה סלקטיבית על מחזיק המורכב חוט כלוריד כסף ולחבר אותו לשקע המחבר הנשי. הסר אלקטרודת התייחסות אחת מן הכוס עם אשלגן כלורי, הצבת אצבע אחת בקצה אחד והטיית נימי הזכוכית לכיוון אצבע זו כדי למנוע את אגר לנשור.
בזהירות למקם קצה אחד לתוך המחזיק, להבטיח כי לא נוצרות בועות. אם יש בועה, להסיר את אלקטרודת הייחוס, למלא את המחזיק עם שלושה אשלגן כלורי טוחן ולחזור. מקם את מחזיק האלקטרודה בשקע המחבר הנשי.
לאחר הכיול, לנתח את האיבר. מניחים את צלחת הפולי-L-ליזין עם הדגימה המנותחת על במת המיקרוסקופ ומכניסים את קצה אלקטרודת הייחוס בתוך תמיסת המלח. להטביע את קצה המיקרו-אלקטרוניקה הסלקטיבית של היון בתמיסת המלח, תוך הקפדה שלא לשבור את הקצה.
השתמש בידיות הכוונון הידניות כדי להתאים את מיקום המיקרו-אלקטרוניקה בעת התבוננות מתחת למיקרוסקופ האור. התאם את המיקום האנכי של המיקרואלקטרודה כך שהקצה שלו יהיה באותו מישור כמו האיבר או הרקמה, ואז סובב את מתג המנוע כדי לאפשר. באמצעות מקשי החצים של המחשב, הזז את המיקרואלקטרודה אופקית למיקום המרוחק שלושה מילימטרים מהרקמה כדי למדוד הקלטות רקע.
כאשר אתה מוכן, התחל להקליט על-ידי הקשה על F5, השג חמש מדידות של פעילות ברקע. הזז את קצה microelectrode קרוב לרקמה תוך הקפדה לא לנקב את האיבר. הפחת את רגישות הפגיעה העיקרית כדי למקם את קצה microelectrode שני מיקרומטרים ישירות ימינה, בניצב לרקמה.
להשיג שלוש הקלטות באתר לאורך כרית רקטלית כדי לזהות את האתר של פעילות היונים הגדולה ביותר, ולאחר מכן לקבל מדידות מלוחים בסיסיות באתר המציג את הפעילות הגדולה ביותר. כדי להקליט התכווצויות hindgut, למלא את אחת הבארות בצלחת עם נפח ידוע של תמיסת מלח Aedes. לאחר הניתוח, מעבירים בזהירות את ההינדגוט המנותח המחובר לבטן האמצעית לבאר בצלחת אחרת, ומקפידים לא לצבוט את האילום.
שקועים במעיים בתמיסת המלח בתוך הבאר ומניחים סיכות מינוטין לתוך המעיים האמצעיים ופי הטבעת. ileum לא צריך להיות תחת מתח התכווצויות ספונטניות שמקורן בשסתום פילורי באיליאום הקדמי יש לראות. חבר את מצלמת הווידאו למיקרוסקופ הסטריאוסקופי.
לאחר מכן מניחים את המנה המכילה את האיבר המנותח מתחת למיקרוסקופ ולהקליט וידאו במשך שתי דקות. יישום של DH31 נגד צינורות Malpighian unstimulated גורם לעלייה משמעותית בשיעור הפרשת נוזלים, המאשר את תפקידו כהורמון משתן יתושים Aedes. כאשר טובולות מטופלות עם AedaeCAPA-1, ירידה בשיעור הפרשה הוא ציין DH31 מגורה צינורות Malpighian.
אלקטרודות סלקטיביות יון שימשו למדידת ריכוזי נתרן בטיפות המופרשות. טיפול DH31 על MTs לא הייתה השפעה על ריכוז הנתרן בטיפת המופרשת. עם זאת, עם היישום של AedaeCAPA-1, ריכוז הנתרן בנוזל המופרש גדל באופן משמעותי.
בנוסף, בהשוואה לבקרות לא מגורות, DH31 הוביל לקצב הובלת נתרן גדול יותר באופן משמעותי, ואילו AedaeCAPA-1 ביטל עלייה זו בצינורות מגורה DH31. ה- SIET שימש להערכת שינויים בהובלת נתרן לאורך אפיתל כרית פי הטבעת של יתושים נקבות בוגרות. אנלוגי לוקוקינין שימש לבחינת שינויים בספיגת הנתרן, מה שגרם לירידה של פי ארבעה בספיגת הנתרן בהשוואה לשליטה מלוחה.
כדי להעריך את התפקיד של pyrokininin neuropeptide2 על תנועתיות ileal, נעשה שימוש באנלוגי של רודניוס פרוליקסוס, אשר הוכח בעבר כדי להפעיל את קולטן A.aegypti PK2 מועשר ileum יתוש. יחסית לרמות הבסיס, PK2 מעכב באופן משמעותי התכווצויות ileal. בעת ביצוע בדיקת רמזי עם טובולות Malpighian ומדידת שיעורי הפרשת יונים או נוזלים, זה הכרחי כי צינורות לא ניזוקו במהלך הניתוח או במהלך ההעברה לתוך צלחת הבדיקה.
בעקבות בדיקת רמזי, מובילי ממברנות ספציפיים יכולים להיות ממוקדים או פרמקולוגית או מולקולרית באמצעות טכניקות גנטיות הפוכות כדי להבחין בתרומתם הספציפית להובלה טרנס-אפיתל של מסיסים באפיתל הפשוט.
