Bu protokol, küçük hayvan fizyologları tarafından sindirim ve boşaltım sistemini düzenleyen nöropeptidlerin ve diğer hormonal faktörlerin rolünü aydınlatmak için kullanılabilecek teknikleri açıklar. Bu teknikler, kemirgenler ve teleus da dahil olmak üzere daha büyük hayvan modelleri için özel olarak tasarlanmış teknikler kullanılarak mümkün olmayacak mikro boyutlu biyolojik örneklerin ölçülmesine izin verir. Bu yöntem, epitel taşıma da dahil olmak üzere bağırsak endokrin düzenlemesinin yanı sıra böceklerde ve benzer büyüklükteki böcek olmayan türlerde gastrointestinal sistemle ilişkili düz kas hakkında fikir verebilir.
Böcek renal tubal prosedürlerini gösteren farwa Sajadi olacak, laboratuvarımdan bir doktora adayı. Ayrıca, laboratuvarımdan aryan Lajevardi'den eski bir yüksek lisans öğrencisi arka odaklı protokolleri gösterecek. Ramsay'i hazırlayarak başlayın ve daralma deneyler için yemekleri test eder.
Pipet kullanın ve kuyuları 20 mikrolitreye kadar çözelti ile doldurun. Uyarılmamış kontroller için kuyuları 20 mikrolitre Aedes saline Schneider'ın ortamıyla doldurun. Tüm kuyular doldurulduktan sonra, kuyular ve Minutien pimleri suya gömülene kadar nemlendirilmiş mineral yağı test kabına dökün.
Tübülleri kuyuya batırdıktan sonra, tübüllerin proksimal ucunun toparlama ile alın, banyo damlacığı çıkarın ve ucunun pimin etrafına sarın. Boruyu, banyo damlacığında kalan tübül uzunluğunu diğer tübüllerle tutarlı tutarak iki kez pimin etrafına sarın. Sodyum seçici bir mikroelektorit yapmak için, elektrodu 100 milimoler sodyum klorürle doldurmak için bir mililitre şırınga kullanın.
Dolgu çözeltisinin elektrot ucuna kadar dolduğundan emin olun. Hava kabarcıkları ortaya çıkarsa, mikroelekrodu hafifçe hareket ettirin veya çözeltiyi çıkarın ve yeniden doldurun. Sodyum seçici iyonofor çözeltisine 10 mikroliter pipet ucu batırın.
Elektrodu pipete dik olarak hizalayın, ardından basınç oluşturmak ve küçük bir damla iyonophore atmak için ucun altına eldivenli bir parmak yerleştirin. İyonofor damlasına mikroelektofit ucuna dikkatlice dokunun, kırılmamasını kesin. Küçük bir kabın yarısını 100 milimolar sodyum klorürle doldurun ve kabın üst kısmına bir miktar modelleme kili yerleştirin.
İyonofor alındıktan sonra, elektrot ucunu kabın duvarına yerleştirin ve uçları sodyum klorür içinde bırakarak yerleştirin. İsME'yi kullanıma hazır olana kadar kabın içinde tutun. ISME referans elektrotunu yapmak için, bir elektrodu 500 milimolar potasyum klorürle doldurun ve bir beherde saklayın.
Elektrot uçlarını, parafin yağına batırıldığında iyonoforenin yer değiştirmesini önlemek için tetrahidrofuranda çözünmüş yaklaşık% 3,5 polivinil klorür çözeltisi kullanarak kaplayın. Sodyum elektrodu kalibre etmek için, 10 mikroliter sodyum klorür standart konsantrasyonu damlacığını, kuluçkalanmış Malpighian tübülleri ile Ramsey çanağının kenarına yerleştirin. Standart damlacıkları iki santimetre arayla, üstüne daha yüksek konsantrasyonla yerleştirin.
Klorür gümüş tellerinin üzerine hem referans elektrot hem de iyon seçici elektrot yerleştirin ve mikro manipülatörlere bağlı elektrot tutucuları kullanarak güvenli bir şekilde sabitleyin. Mikro manipülatörleri kullanarak her iki elektrodu da 200 milimolar sodyum klorür damlacığı doğru yönlendirin ve elektro uçların çanağın dibine dokunmamasını sağlayın. Kayda başlamak ve okumanın sabitlenmesine izin vermek için elektrometreyi açın.
Okumayı kaydedin ve bir sonraki standarda devam edin. Sıvı salgılama oranının ölçümlerini aldıktan sonra, referans ve iyon seçici elektrotları mikro manipülatörleri kullanarak salgılanan damlacığa dikkatlice taşıyın. Kaydı açın ve okumanın sabitlenmesine izin verin, sonra kaydedin.
IPA-2 İyon/Polarografik Amplifikatörü, ışık mikroskobu ve bilgisayarları açın. Sodyum seçici mikroelekrotu gümüş bir klorür telden oluşan bir tutucuya yerleştirin ve dişi konektör jakına takın. Potasyum klorür ile beherden bir referans elektrodu çıkarın, bir parmağınızı bir ucuna yerleştirin ve agarın düşmesini önlemek için cam kılcal damarı bu parmağa doğru yatırın.
Bir ucunu tutucuya dikkatlice yerleştirin, kabarcık oluşmamasını sağlayın. Bir kabarcık varsa, referans elektrotu çıkarın, tutucuyu üç azı dişi potasyum klorürle yeniden doldurun ve tekrarlayın. Elektrot tutucuyu dişi konektör jakına yerleştirin.
Kalibrasyondan sonra organı parçalara ayrıştırın. Poli-L-lizin çanağı, parçalanmış numune ile mikroskop aşamasına yerleştirin ve referans elektrodun ucunu salinin içine yerleştirin. İyon seçici mikroelekrod ucunu saline batırın, ucu kırmamaya dikkat edin.
Işık mikroskobu altında bakarken mikroelekrod konumunu ayarlamak için manuel ayar düğmelerini kullanın. Mikroelekrod'un dikey konumunu, ucu organ veya dokuyla aynı düzlemde olacak şekilde ayarlayın, ardından motor anahtarını etkinleştirecek şekilde çevirin. Bilgisayar ok tuşlarını kullanarak, arka plan kayıtlarını ölçmek için mikroelekrodi yatay olarak dokudan üç milimetre uzağa taşıyın.
Hazır olduğunuzda, F5 tuşuna basarak kayda başlayın, beş arka plan etkinliği ölçümü elde edin. Mikroelekrod ucunu organı delmemeye dikkat ederek dokuya yaklaştırın. Mikroelektrod ucunu dokuya dik, doğrudan sağa doğru iki mikrometre yerleştirmek için tuş isabet hassasiyetini azaltın.
En büyük iyon aktivitesinin yerini belirlemek için rektal ped boyunca sahada üç kayıt elde edin, ardından en büyük aktiviteyi görüntüleyen sahada temel salin ölçümleri elde edin. Arkadaki kasılmaları kaydetmek için, yemekteki kuyulardan birini bilinen bir Aedes salin hacmi ile doldurun. Diseksiyondan sonra, orta bağırsağa bağlı parçalanmış arkalığı dikkatlice başka bir tabaktaki bir kuyuya aktarın ve ileumu çimdiklememeye dikkat edin.
Bağırsakları kuyunun içindeki saline batırın ve Minutien pimlerini orta bağırsak ve rektum içine yerleştirin. İleum gerginlik altında olmamalıdır ve ön ileumdaki pilorik kapaktan kaynaklanan spontan kasılmalar gözlenmelidir. Video kamerayı stereoskopik mikroskopa bağlayın.
Daha sonra parçalanmış organı içeren kabı mikroskop altına yerleştirin ve iki dakika boyunca bir video kaydedin. DH31'in uyarılmamış Malpighian tübüllerine karşı uygulanması, Aedes sivrisineklerinde idrar söktürücü hormon olarak rolünü doğrulayan sıvı salgılama oranında önemli bir artışa neden olur. Tübüller AedaeCAPA-1 ile tedavi edildiğinde, DH31 uyarılmış Malpighian tübüllerinde salgı oranında bir azalma gözlenir.
Salgılanan damlacıklardaki sodyum konsantrasyonlarını ölçmek için iyon seçici elektrotlar kullanıldı. DH31'in MT'ler üzerinde tedavisinin salgılanan damlacıktaki sodyum konsantrasyonu üzerinde hiçbir etkisi olmadı. Bununla birlikte, AedaeCAPA-1 uygulaması ile salgılanan sıvıdaki sodyum konsantrasyonu önemli ölçüde artmıştır.
Ek olarak, uyarılmamış kontrollerle karşılaştırıldığında, DH31 önemli ölçüde daha fazla sodyum taşıma oranına yol ken, AedaeCAPA-1 DH31'deki bu artışı kaldırmıştır. SIET, yetişkin dişi sivrisineklerin rektal ped epitel boyunca sodyum taşımacılığındaki değişiklikleri değerlendirmek için kullanıldı. Sodyum emiliminde yapılan değişiklikleri incelemek için bir lökokinin analog kullanıldı, bu da sodyum emiliminde salin kontrolüne kıyasla dört kat azalmaya neden oldu.
Bir nöropeptid pyrokinin2'nin ileal hareketlilik üzerindeki rolünü değerlendirmek için, daha önce sivrisinek ileumda zenginleştirilmiş A.aegypti PK2 reseptörini aktive ettiği gösterilen bir Rhodnius prolixus analogu kullanıldı. Temel seviyelere göre, PK2 ileal kasılmaları önemli ölçüde inhibe eder. Malpighian tübülleri ile Ramsay tahlilini yaparken ve iyon veya sıvı salgılama oranlarını ölçerken, tübüllerin diseksiyon sırasında veya tahlil çanağına transfer sırasında zarar görmemesi zorunludur.
Ramsay tahlilinin ardından, spesifik membran taşıyıcıları, basit epiteldeki solutların transepithelial taşınmasına özel katkılarını ayırt etmek için ters genetik teknikler kullanılarak farmakolojik veya moleküler olarak hedeflenebilir.
