奥多纳塔电介质介质RNA干扰法

这是一种用于奥多纳塔电穿孔中位RNA干扰方法的视频协议。龙和水坝，秩序奥多纳塔的成员，是最祖先的昆虫之一。成人奥多纳塔在身体颜色和图案上表现出显著的多样性，并且已经进行了许多生态和行为研究。

然而，由于基因功能分析非常困难，对奥多纳塔的分子遗传学研究一直缺乏。例如，传统的RNAi方法对奥多纳塔物种无效。最近，我们建立了一种与体内电穿孔相结合的RNM方法。

在这里，我们为电穿孔的RNAi提供了一个视频协议，既包括蛾子，也包括水坝。作为我们代表性的水坝物种，我们自己使用蓝尾水坝。Ischnura 塞内加尔。

这是最常见的水坝物种之一，经常出现在日本阳光明媚的池塘。首先，我们展示RAI协议，针对一个水坝的腹部，伊施努拉塞内加尔。在冰冷麻醉后，在原盘两侧的两个针脚，并固定幼虫到固定支架上。

使用钳子拉动和拉伸第七和第八腹部段之间的段间膜。保持部际膜用手拉伸。将准备好的毛细管的尖端插入拉伸的分段膜中。

注射1微升的siRNA或dsRNA溶液。使用钳子在幼虫表面涂抹两滴超声波凝胶。将电极放在超声波凝胶上，在注射的一侧放置正极。

使用电穿孔器生成 10 次电穿孔脉冲。用纸焊擦去表面的剩余凝胶。取出昆虫针，将经过处理的幼虫放在湿纸巾上大约一天，以进行恢复。

接下来，我们展示RAI协议，该协议针对的是大坝的胸口，伊施努拉·塞内森西斯。冰冷麻醉后，在原盘两侧连接两个针脚，将幼虫固定在固定支架上。用手拉和拉伸前三角和合成器之间的分段膜。

将准备好的毛细管的尖端插入拉伸的分段膜中。注射一微升的siRNA或dsRNA溶液。用钳子在幼虫表面涂抹两滴超声波凝胶。

将电极放在超声波凝胶上，注射侧有正极。使用电丙子生成 10 次电穿孔脉冲。用纸焊擦去表面的剩余凝胶。

取出昆虫针，将经过处理的幼虫放在湿纸巾上大约一天，以进行恢复。作为一个具有代表性的喵鱼种，我们使用皮德掠食者。伪特米斯 · 佐纳塔

这是最常见的龙类之一，经常出现在日本阴凉的池塘里。最后，我们显示了RMIS协议针对一只小动物的腹部，伪僵尸佐纳塔。在第四和第五腹部段之间拉伸分段膜。

在第四和第五腹部段之间用细针做一个小孔。将准备好的毛细管的尖端插入准备好的孔中。注射一微升的siRNA或dsRNA溶液。

使用销将幼虫固定在固定支架上。使用钳子在幼虫表面涂抹两滴超声波凝胶。将电极放在超声波凝胶上，将正极放在喷射侧。

使用电穿孔器生成 10 次电穿孔脉冲。用纸焊擦去表面的剩余凝胶。取出昆虫针，将经过处理的幼虫放在湿纸巾上大约一天，以进行恢复。

在这里，我们选择了黑色素合成基因MCO2作为靶基因，而EGFP或bla作为负控制靶点。MCO2对于各种昆虫的黑颜色形成至关重要。首先，我们显示的结果在希努拉塞内加内森西斯的腹部。

白色箭头表示压抑的黑色色素沉着区域，其中正极被放置在电穿孔上。通过siRNA治疗和dsRNA治疗，观察到色素沉着的孵化。RNI表型的大小和位置在个体之间差别很大。

没有电穿孔，没有RNI表型被观察到，表明电穿孔对于该物种的RNI至关重要。接下来，我们展示在希努拉塞内加内森西斯的胸图的结果。同样，在正极置于电穿孔区域周围也观察到黑色色素沉着的抑制。

最后，我们显示了伪特米斯佐纳塔腹部的结果。正如预期的那样，在正极被放置在电穿孔区域周围检测到RNI表型。我们确认电丙化调理RNAi方法在奥多纳塔非常有用。

它可以诱导局部基因抑制几乎100%的效率。至少在表皮，当我们选择适当的发展阶段。此方法在 CRISPR/Cas9 方法上具有多个方法。

例如，RNAi 表型出现区域可以通过电位时正极的位置进行控制，并且 RNA 表型可以很容易地与同一个体中并排的受控表型进行比较。此外，这种方法不需要微注射到微小的鸡蛋。因此，与CRISPR/Cas9方法更快观察表型要容易、更快。

此外，这种方法可以应用于新产的卵子难以收集的昆虫。例如，伪僵尸佐纳塔的女性在飞行过程中产卵。因此，收集他们新产的鸡蛋是非常困难的。

我们预计，当常规 RNI 不能有效工作时，此协议可能一般适用于非模型生物体。