هذا هو بروتوكول الفيديو لأسلوب تدخل الحمض النووي الريبي بوساطة كهربائية في أودوناتا. اليعسوب وdamelflies ، وأعضاء في النظام Odonata ، هي من بين الحشرات الأكثر أجداد. البالغين أودوناتا تظهر تنوع ملحوظ في ألوان الجسم وأنماط، وأجريت العديد من الدراسات الإيكولوجية والسلوكية.
ومع ذلك، كانت الدراسات الوراثية الجزيئية في أودوناتا تفتقر، لأن التحليل الوظيفي للجينات أمر صعب للغاية. على سبيل المثال، الطريقة RNAi التقليدية ليست فعالة في أنواع أودوناتا. في الآونة الأخيرة، أنشأنا طريقة RNM في تركيبة مع في الكهربائية في الجسم الحي.
هنا، ونحن نقدم بروتوكول الفيديو لRNAi بوساطة الكهربائية في كل من اليعسوب وdamelflies. كما لدينا الأنواع السدود تمثيلية نستخدم السد الأزرق الذيل. (أيشنورا) السنغالي.
هذا هو واحد من الأنواع الأكثر شيوعا damselfly وغالبا ما توجد في البرك المشمسة في اليابان. أولا، نعرض بروتوكول RNAi التي تستهدف البطن من damselfly، اشنورا السنغالية. بعد التخدير البارد في الجليد في أن اثنين من الدبابيس على جانبي البروثوراس وإصلاح اليرقة إلى موقف ثابت.
سحب وتمتد الغشاء بين القطاعية بين الجزء البطني السابع والثامن باستخدام ملقط. الحفاظ على الغشاء بين القطاعية امتدت باليد. أدخل طرف الشعيرات الدموية المعدة في الغشاء المتمدد بين القطاعات.
حقن 1 ميكرولتر من محلول سيرنا أو dsRNA. تطبيق اثنين من قطرات من هلام الموجات فوق الصوتية على سطح اليرقات باستخدام ملقط. وضع الأقطاب الكهربائية على هلام الموجات فوق الصوتية، مع القطب الموجب على جانب الحقن.
توليد نبضات كهربائية 10 مرات باستخدام كهربائي. امسح الجل المتبقي على السطح بورق. إزالة دبابيس الحشرات والحفاظ على اليرقات المعالجة على منشفة ورقية مبللة لمدة يوم واحد تقريبا للانتعاش.
بعد ذلك، نعرض بروتوكول RNAi الذي يستهدف الصدر من damnnsis damselfly، Ischnura السنغال. بعد التخدير البارد الجليد نعلق اثنين من دبابيس على جانبي البروثوراس وإصلاح اليرقة إلى موقف ثابت. سحب وتمتد الغشاء بين القطاعات بين prothorax وsthorax باستخدام اليد.
أدخل طرف الشعيرات الدموية المعدة في الغشاء المتمدد بين القطاعات. حقن ميكرولتر واحد من محلول سيرنا أو ديسرنا. تطبيق اثنين من قطرات من هلام الموجات فوق الصوتية على سطح اليرقة باستخدام ملقط.
وضع الأقطاب الكهربائية على هلام الموجات فوق الصوتية، مع القطب الموجب على جانب الحقن. توليد نبضات كهربائية 10 مرات باستخدام الكهربائي. امسح الجل المتبقي على السطح بورق.
إزالة دبابيس الحشرات والحفاظ على اليرقات المعالجة على منشفة ورقية مبللة لمدة يوم واحد تقريبا للانتعاش. كجنس اليعسوب التمثيلي نستخدم اليعسوب المكشط بيد. (بُوُوثيميس زونتا)
هذا هو واحد من أنواع اليعسوب الأكثر شيوعا وغالبا ما توجد في البرك ظليلة في اليابان. وأخيراً، نعرض بروتوكول RNI الذي يستهدف بطن اليعسوب، Pseudothemis zonata. تمتد الغشاء بين القطاعات بين الجزء الرابع والخامس من البطن.
جعل ثقب صغير مع إبرة غرامة بين الجزء الرابع والخامس من البطن. إدراج غيض من شعرية معدة في حفرة المعدة. حقن ميكرولتر واحد من محلول سيرنا أو ديسرنا.
إصلاح اليرقة إلى موقف ثابت باستخدام دبابيس. تطبيق اثنين من قطرات من هلام الموجات فوق الصوتية على سطح اليرقات باستخدام ملقط. ضع أقطاب كهربائية على جل الموجات فوق الصوتية مع القطب الموجب على جانب الحقن.
توليد نبضات كهربائية 10 مرات باستخدام كهربائي. امسح الجل المتبقي على السطح بورق. إزالة دبابيس الحشرات والحفاظ على اليرقات المعالجة على منشفة ورقية مبللة لمدة يوم واحد تقريبا للانتعاش.
هنا اخترنا جين تخليق الميلانين MCO2 الجين المستهدف ، وEGFP أو bla كهدف تحكم سلبي. MCO2 ضروري لتشكيل اللون الأسود في الحشرات المختلفة. أولا نعرض النتائج في البطن من سيسنورا سنينسنينسيس.
تشير رؤوس الأسهم البيضاء إلى مناطق التصبغ الأسود المكبت حيث تم وضع القطب الموجب على الإلكتروبوريشن. وقد لوحظ احتضان التصبغات من خلال العلاج من قبل الرنا وعلاج DSRNA. 21- وقد تباينت طبيعة النمط الظاهري للنمط الظاهر في RNI وموقعه تفاوتاً كبيراً بين الأفراد.
دون electroporation لم يلاحظ أي الأنماط الظاهرية RNI، مما يشير إلى أن الكهربائي ضروري لRNI في هذا النوع. بعد ذلك، نعرض النتائج في صدر اشنورا سنينسنسيس. وبالمثل لوحظ تثبيط التصبغ الأسود في جميع أنحاء المنطقة حيث تم وضع القطب الموجب على electroporation.
وأخيرا، نعرض النتائج في البطن من زوناتا الزائفة. وكما هو متوقع، تم الكشف عن النمط الظاهري RNI في جميع أنحاء المنطقة حيث تم وضع القطب الموجب على الأقطاب الكهربائية. ونؤكد أن الأسلوب RNAi بوساطة البروفة الكهربائية مفيد جدا في أودوناتا.
يمكن أن تحفز على قمع الجينات المحلية ما يقرب من 100٪ كفاءة. على الأقل في البشرة، عندما نختار مراحل النمو المناسبة. هذا الأسلوب على عدة عبر أسلوب CRISPR/Cas9.
على سبيل المثال، يمكن التحكم في المنطقة التي تظهر فيها الأنماط الظاهرية RNAi من خلال موضع الأقطاب الموجبة عند الكهربة، ويمكن مقارنة الأنماط الظاهرية للرنا بسهولة مع الأنماط الظاهرية للتحكم جنبًا إلى جنب في نفس الفرد. وعلاوة على ذلك، هذه الطريقة لا تتطلب الحقن المجهري في البيض صغيرة. لذلك فمن الأسهل بكثير وأسرع لمراقبة النمط الظاهري أسرع من أسلوب CRISPR / Cas9.
وعلاوة على ذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الحشرات التي يصعب جمع بيضها الذي تم وضعه حديثًا. على سبيل المثال، تضع الإناث من Pseudothemis zonata البيض أثناء الطيران. لذلك فمن الصعب جدا لجمع البيض وضعت حديثا.
ونتوقع أن يكون هذا البروتوكول قابلاً للتطبيق عموماً على الكائنات غير النموذجية عندما لا يعمل نظام RNI التقليدي بكفاءة.
