Creazione e manutenzione di una biobanca vivente come lo facciamo. Introduzione. Le biobanche tradizionali contengono comunemente campioni di tessuto e sangue non vitali. Nonostante riflettano adeguatamente la diversità delle popolazioni di pazienti oncologici e consentano analisi genetiche e istologiche, non sono adatte per saggi preclinici che valutano le strategie terapeutiche.
Una biobanca che integra anche modelli derivati dal paziente supera questi limiti. Consentendo così test funzionali per la medicina di precisione. Acquisizione campionona.
Per il biobanking del cancro colorettale e pancreatico, eleggere casi con diagnosi comprovata e dimensioni tumorali sufficienti, è obbligatorio un concent informato del paziente. Prima dell'inizio dell'intervento chirurgico, preleva 20 ml di sangue usando una siringa eparinata e ulteriori 7,5 ml con una monovetta sierici. Lavorazione del siero e isolamento PBL.
Dopo la centrifugazione a 1.128 RCF per 15 minuti a quattro gradi il siero viene aliquoto in un criotubo pre-etichettato e direttamente immerso nell'azoto liquido. Il sangue eparinato viene trasferito in un tubo di polipropilene e diluito con PBS da 15 ml. Utilizzare una pipetta sierologica per sottofondare lentamente la miscela con Pancoll da 15 ml.
Dopo la centrifugazione del gradiente di densità, lo strato opaco contenente le cellule mononucleari viene ripreso con una pipetta sierologica e trasferito in un nuovo tubo PP. Dopo il lavaggio con PBS e la pellettizzazione delle cellule mononucleari mediante centrifugazione, scartare il supernatante e rimescolare il pellet nel mezzo congelatore e erogare in criotubi preetichetti. Trasferire i tubi in un contenitore di raffreddamento adatto al congelamento lento con un grado al minuto e conservare temporaneamente a 80 gradi.
Lavorazione tissutale. Non appena il campione di tessuto viene reinsediato dal chirurgo, mettilo in un contenitore adatto. Evitare in tutte le circostanze che il tessuto sia coperto di formalina.
Trasporto il più velocemente possibile alla patologia per l'escissione di materiale tumorale non rilevante per la valutazione patologica dei margini di resezione. Il pezzo tumorale deve essere maneggiato il più asettico possibile. Inoltre, ottenere un campione di tessuto sano e posizionare entrambi in tubi separati precompilato con soluzione di stoccaggio dei tessuti sul ghiaccio.
Tornare immediatamente in laboratorio per iniziare la lavorazione dei tessuti in condizioni sterili. Il pezzo di tessuto viene posto su un piatto di plastica sterile riempito con soluzione di stoccaggio dei tessuti per evitare l'essiccazione. Prima di tutto, asportare uno o più pezzi delle dimensioni di pinhead per il congelamento a scatto a seconda delle dimensioni del campione di tessuto ottenuto.
Posizionare il tessuto nativo in criotubi pre-etichettati e immergersi immediatamente nell'azoto liquido. Tagliare il tessuto rimanente a cubetti di tre per tre per tre millimetri cubi. Tenere conto del fatto che il tessuto necrotico deve essere sezionato completamente ma non deve essere scartato.
Disporre i cubi in quadrupli per determinare il numero di aliquote per l'archiviazione vitale. Etichettare un numero adeguato di criotubi e pre-riempirli con un mezzo congelatore da 1,5 ml ciascuno. Poiché il DMSO nel mezzo congelatore è citotossico, eseguire i passaggi successivi rapidamente e senza interruzioni.
Utilizzare una lama bisturi per raccogliere quattro pezzi di tessuto per tubo. Assicurarsi che tutti i pezzi siano completamente immersi nel mezzo congelatore idealmente nella parte inferiore del tubo e congelare rapidamente i tubi utilizzando un contenitore di congelamento. Procedere allo stesso modo con l'esemplare sano.
Per lo stoccaggio a lungo termine, conservare tutte le aliquote in un serbatoio di azoto liquido. Coltura cellulare. Macinare i resti dell'elaborazione del tessuto tumorale, comprese le porzioni necrotiche con le lame del bisturi il più piccole possibile.
Posizionare un filtro cellulare nella parte superiore di un tubo pp steril e aspirare la sospensione con una pipetta sierologica per passare attraverso il filtro cellulare. Utilizzare lo stantuffo di una siringa monouso per premere il tessuto rimane attraverso il filtro cellulare per generare una singola sospensione cellulare. Risciacquare con PBS e ripetere questi passaggi fino a quando non è rimasto materiale.
Rimuovere il filtro cellulare e centrifugare la sospensione a 180 RCF per sette minuti. Nel frattempo, preparare una piastra a sei pozzi pre-rivestita di collagene con diverse composizioni mediali per aumentare la probabilità di crescita del tumore. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in PBS e erogare 500 microlitri per pozzo.
Successivamente, posizionare la piastra in un incubatore standard. Generazione di xenoinnesto derivato dal paziente. Per la generazione di xenoinnesti derivati dal paziente in topi immunocomprodotti, gli animali devono essere tenuti in uno specifico ambiente privo di agenti patogeni.
Indossare dispositivi di protezione individuale composti da scrub, grembiule, maschera per il viso, copricapelli e guanti. Dopo aver organizzato il tuo spazio di lavoro, prendi il campione di tumore del desiderio dal contenitore di azoto liquido. Riempire un tubo in PP fresco con PBS da 35 ml, quindi lavare attentamente il processo di scongelamento e inclinare il tubo criogenico su e giù.
Non appena il contenuto diventa soluso, versato nel PBS e risciacquare i pezzi tumorali. Scartare la maggior parte del PBS e svuotare i cubi nel coperchio. Mettere un piatto di plastica sterile su una confezione di ghiaccio e aggiungere una goccia di Matrigel da 100 microlitri.
Utilizzare le forcep per posizionare i pezzi tumorali nel Matrigel e incubare il tumore per 10 minuti. Nel frattempo, anestetizza due topi. Controlla la profondità dell'anestesia pizzicando il piede dell'animale.
Qualsiasi movimento indica un'anestesia insufficiente e richiede un po 'di attesa o un ulteriore dosing. Applicare unguento per gli occhi, pizzicare il mouse per il collo e iniettare un microchip per via sottocutanea. Eseguire i seguenti passaggi in parallelo.
Disinfettare i fianchi dei topi e fare una piccola incisione cutanea con forbici Metzenbaum a strisce e formare una tasca sottocutanea con preparazione smussata. Utilizzare le forcep anatomiche per inserire i pezzi tumorali. Assicurarsi che il pezzo sia posizionato all'estremità posteriore della tasca della pelle.
Aspirare il Matrigel rimanente e distribuire equamente a tutte e quattro le tasche. Attendere la polimerizzazione del gel e chiudere la pelle con suture a pulsante singolo senza danneggiare i pezzi tumorali con l'ago. Tagliare il filo il più corto possibile sopra il nodo e applicare la medicazione spray per evitare il noying delle suture.
Scansionare il microchip e aggiungere le informazioni sul tumore al database per una successiva identificazione dell'animale. Preparare una gabbia con biancheria da letto fresca e materiale di nidificazione, posizionare i topi davanti a una lampada a infrarossi e monitorare l'animale fino a quando l'anestesia non si è pladata. Espianto di PDX.
Dopo che il tumore PDX ha raggiunto le dimensioni richieste, il topo viene eutanasiato dall'asfissia di CO2 e dalla successiva lussazione cervicale. Sezionare con cura la pelle dal tumore e rimuovere completamente il PDX. Risultati rappresentativi.
Posizionare un tumore su un piatto di plastica sterile e utilizzare lame di bisturi sterili per un'ulteriore lavorazione. Tagliare il foro con le fette, metterli in una cassetta istologia e immergersi in formalina per generare un campione incorporato di paraffina per la valutazione istologica in un secondo momento. Trasferire il resto del tumore alla soluzione di stoccaggio dei tessuti e creare un nuovo campione congelato vitale conservato e snap per la biobanca.
Inoltre, utilizzare i resti del tumore PDX analoghi alla coltura cellulare capitolina per stabilire linee cellulari tumorali secondarie. Per generare ulteriore PDX, trasferire due o più pezzi tumorali con Matrigel a un nuovo mouse ricevente come mostrato in precedenza. conclusione. Attraverso il protocollo presentato, siamo finora riusciti a stabilire nove linee cellulari tumorali pancreatiche e più di 100 colorettali derivate dal paziente, oltre a 19 modelli pancreatici e oltre 150 pdx colorettali.
