Создание и поддержание живого биобанка, как мы это делаем. Знакомство. Традиционные биобанки обычно содержат нежизнеспособность тканей и образцов крови. Несмотря на адекватное отражение разнообразия популяций онкологических больных и разрешение генетических и гистологических анализов, они непригодны для доклинкологических анализов, оценивающих терапевтические стратегии.
Биобанк, интегрируя также модели, полученные пациентами, преодолевает эти ограничения. Таким образом, позволяет функциональное тестирование на точность медицины. Приобретение образцов.
Для биобанкинга колоректального и поджелудочного рака, избрать случаи с проверенным диагнозом, а также достаточный размер опухоли, информированный concent пациента является обязательным. До начала операции нарисуйте 20 мл крови с помощью гепаринизированного шприца и еще 7,5 мл с помощью сыворотки моноветта. Обработка сыворотки и изоляция PBL.
После центрифугации при 1, 128 RCF в течение 15 минут при четырех градусах сыворотка алицитирована в предварительно маркированной криотрубе и непосредственно погружена в жидкий азот. Гепаринизированная кровь передается в полипропиленовую трубку и разбавляется 15 мл PBS. Используйте серологическую пипетку, чтобы медленно подложить смесь с 15 мл Pancoll.
После центрифугации плотности непрозрачный слой, содержащий моноядерные клетки, подхвасывался серологическим пипеткой и передавались в новую трубку PP. После мытья с PBS и гранулирования моноядерных клеток центрифугации, отказаться от супернатанта и повторно гранулы в морозильной камере среды и обойтись в предварительно помеченные криотрубы. Перенесите трубки в охлаждающий контейнер, пригодный для медленного замораживания с одним градусом в минуту и храните временные при 80 градусах.
Обработка тканей. Как только образец ткани будет повторно обнаружен хирургом, поместите его в подходящий контейнер. Избегайте при любых обстоятельствах, что ткань покрыта формалином.
Транспорт как можно быстрее к патологии для иссечения опухолевого материала не имеет отношения к патологической оценке поля ресекции. Опухоль кусок должен быть обработан как септик, как это возможно. Кроме того, получить образец здоровой ткани и поместить как в отдельные трубы предварительно заполнены с тканью хранения раствора на льду.
Немедленно возвращайтесь в лабораторию, чтобы начать обработку тканей в стерильных условиях. Часть ткани помещается на стерильную пластиковую тарелку, наполненную раствором для хранения тканей, чтобы избежать высыхания. Прежде всего, акциз один или несколько булавочных размеров штук для оснастки замораживания в зависимости от размера ткани образца получены.
Поместите родную ткань в предварительно помеченные криотрубки и немедленно погрузите в жидкий азот. Оставшуюся ткань нарезать кубиками по три на три кубических миллиметра. Примите во внимание, что некротические ткани должны быть полностью вскрыты, но не должны быть отброшены.
Упорядочить кубы в четыре раза, чтобы определить количество aliquots для жизненно важного хранения. Этикетка достаточное количество криотрубов и предварительно заполнить их с 1,5 мл морозильник среды каждый. Так как DMSO в морозильной камере среды цитотоксических, выполняется следующие шаги быстро и без перерыва.
Используйте скальпель лезвия, чтобы зачерпнуть четыре части ткани на трубку. Убедитесь, что все части полностью погружены в морозильную камеру среды идеально в нижней части трубки и быстро заморозить трубки с помощью замораживания контейнера. Продолжайте таким же образом со здоровым экземпляром.
Для длительного хранения храните все алициты в резервуаре с жидким азотом. Культура клеток. Измельчить остатки обработки опухолевых тканей, в том числе некротических частей скальпеля лезвия как можно меньше.
Поместите клеточный ситечко в верхней части стерильной трубки PP и аспирировать подвеску серологическим пипеткой, чтобы пройти через клеточный ситечко. Используйте поршень одного шприца использования, чтобы нажать ткани остается через ситечко клетки для создания одной клеточной подвески. Промыть PBS и повторить эти шаги, пока нет материала слева.
Удалите клеточный ситечко и центрифугу подвески при 180 RCF в течение семи минут. В то же время, подготовить коллагена предварительно покрытием шесть хорошо пластины с различными составами средств массовой информации, чтобы увеличить вероятность роста опухоли. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите гранулы в PBS и выдельте 500 микролитров на колодец.
После этого поместите тарелку в стандартный инкубатор. Поколение ксенотрансплантата, полученного пациентом. Для генерации ксенотрансплантатов, полученных пациентами у мышей с ослабленным иммунитетом, животные должны храниться в конкретной среде, свободной от патогенов.
Носите средства индивидуальной защиты, состоящие из скрабов, фартука, маски для лица, крышки для волос и перчаток. После организации рабочего пространства, возьмите образец опухоли желания из контейнера жидкого азота. Заполните свежую трубку PP с 35 мл PBS затем тщательно мыть процесс оттаивания и наклонить крио трубки вверх и вниз.
Как только содержимое становится слякотным, наливают в PBS и промыть опухолевые кусочки. Отбросьте большинство PBS и опорожните кубики в крышку. Поместите стерильную пластиковую тарелку на пакет со льдом и добавьте каплю из 100 микролитров Matrigel.
Используйте типсы, чтобы поместить кусочки опухоли в Matrigel и инкубировать опухоль в течение 10 минут. В то же время, анестезировать двух мышей. Проверьте глубину анестезии, ущипнув ногу животного.
Любое движение указывает на недостаточную анестезию и требует либо ожидания, либо дополнительной дозирования. Нанесите мазь глаза, прищипните мышь за шею и ввините микрочип подкожно. Проведи следующие шаги параллельно.
Дезинфицировать фланги мышей и сделать небольшой разрез кожи с полосой Metzenbaum ножницами и образуют подкожный карман тупым препаратом. Используйте анатомические типсы, чтобы вставить опухолевые части. Убедитесь, что часть находится на задней части кармана кожи.
Аспирировать оставшиеся Matrigel и распределять поровну на все четыре кармана. Ожидая лечения геля и закрыть кожу с одной кнопки швы, не повреждая опухолевых частей с иглой. Вырезать нить как можно короче над узлом и применять спрей соусом, чтобы предотвратить noying швов.
Сканирование микрочипа и добавить информацию о опухоли в базу данных для более поздней идентификации животного. Подготовь клетку со свежими постельными принадлежностями и вложенным материалом, помещаем мышей перед инфракрасной лампой и следим за животным до тех пор, пока анестезия не утихнет. Эксплантация PDX.
После того, как опухоль PDX достигла требуемого размера, мышь усыпляется путем удушья CO2 и последующего вывиха шейки матки. Тщательно вскрыть кожу из опухоли и удалить PDX полностью. Результаты представительов.
Поместите опухоль на стерильную пластиковую тарелку и используйте стерильные скальпельные лезвия для дальнейшей обработки. Вырезать отверстие с ломтиками, поместить их в гистологии кассеты и погрузиться в формалин для создания парафина встроенный образец для гистологической оценки на более позднее время. Перенесите остальную часть опухоли в раствор для хранения тканей и создайте новый жизненно сохранившийся и застывший образец для биобанка.
Кроме того, используйте остатки опухоли PDX по аналогии с культурой клеток главы для создания вторичных линий опухолевых клеток. Для создания дальнейшего PDX, передать два или более опухолевых частей с Matrigel к новой мыши получателя, как показано ранее. заключение. С помощью представленного протокола, нам до сих пор удалось установить девять поджелудочной железы и более 100 колоректальных пациентов, полученных раковых клеток линий, а также 19 поджелудочной железы и более 150 колоректальных моделей PDX.
