Schaffung und Pflege einer lebenden Biobank, wie wir es tun. Einleitung. Herkömmliche Biobanken enthalten in der Regel nicht lebensfähige Gewebe- und Blutproben. Obwohl sie die Vielfalt der Krebspatientenpopulationen angemessen widerspiegeln und genetische und histologische Analysen ermöglichen, sind sie für präklinische Tests zur Bewertung therapeutischer Strategien ungeeignet.
Eine Biobank, die auch patientenabgeleitete Modelle integriert, überwindet diese Einschränkungen. Damit können Funktionstests für die Präzisionsmedizin durchgeführt werden. Stichprobenerfassung.
Für Biobanking von Dickdarm- und Bauchspeicheldrüsenkrebs, Wahlfälle mit nachgewiesener Diagnose sowie ausreichende Tumorgröße, ist eine informierte Konzentrat des Patienten obligatorisch. Vor Beginn der Operation 20ml Blut mit einer heparinisierten Spritze und weitere 7,5 ml mit einer Serummonovette ziehen. Serumverarbeitung und PBL-Isolierung.
Nach zentrifugieren bei 1, 128 RCF für 15 Minuten bei vier Grad wird das Serum in einem vorbeschrifteten Kryotube aliquoted und direkt in flüssigen Stickstoff getaucht. Das heparinisierte Blut wird in ein Polypropylen-Rohr übertragen und mit 15ml PBS verdünnt. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um die Mischung langsam mit 15ml Pancoll zu unterziehen.
Nach der Dichtegradientenzentrifugation wird die opake Schicht, die die mononukleären Zellen enthält, mit einer serologischen Pipette aufgenommen und in ein neues PP-Rohr übertragen. Nach dem Waschen mit PBS und dem Pelletieren der mononukleären Zellen durch Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Pellet im Gefriermedium wieder aufhängen und in vorbeschriftete Kryoröhren abgeben. Übertragen Sie die Rohre in einen Kühlbehälter, der für langsames Einfrieren mit einem Grad pro Minute geeignet ist, und lagern Sie vorübergehend bei 80 Grad.
Gewebeverarbeitung. Sobald die Gewebeprobe vom Chirurgen resektiert wird, legen Sie sie in einen geeigneten Behälter. Vermeiden Sie unter allen Umständen, dass das Gewebe mit Formalin bedeckt ist.
Transport so schnell wie möglich zur Pathologie zur Exzision von Tumormaterial, das für die pathologische Bewertung der Resektionsränder nicht relevant ist. Das Tumorstück sollte so aseptisch wie möglich behandelt werden. Darüber hinaus erhalten Sie eine Probe von gesundem Gewebe und legen Sie beide in separaten Röhren mit Gewebeaufbewahrungslösung auf Eis vorgefüllt.
Kehren Sie sofort ins Labor zurück, um mit der Gewebeverarbeitung unter sterilen Bedingungen zu beginnen. Das Gewebestück wird auf eine sterile Kunststoffschale gelegt, die mit einer Gewebeaufbewahrungslösung gefüllt ist, um eine Austrocknung zu vermeiden. Erstens, Verbrauch eines oder mehrerer Pinhead-große Stücke für Snap Freezing in Abhängigkeit von der Größe der Gewebeprobe erhalten.
Das native Gewebe in vorbeschriftete Kryoröhren geben und sofort in flüssigen Stickstoff eintauchen. Schneiden Sie das restliche Gewebe in Würfel von drei mal drei mal drei Kubikmillimetern. Berücksichtigen Sie, dass nekrotisches Gewebe vollständig seziert werden muss, aber nicht verworfen werden sollte.
Ordnen Sie die Würfel in Vierern an, um die Anzahl der Aliquots für die lebenswichtige Lagerung zu bestimmen. Beschriften Sie eine ausreichende Anzahl von Kryoröhren und füllen Sie sie mit jeweils 1,5 ml Gefriermedium vor. Da das DMSO im Gefriermedium zytotoxisch ist, die nächsten Schritte schnell und ohne Unterbrechung durchgeführt.
Verwenden Sie ein Skalpell klingen, um vier Gewebestücke pro Rohr zu schöpfen. Stellen Sie sicher, dass alle Teile vollständig in Gefriermedium eingetaucht sind, idealerweise an der Unterseite des Rohres und frieren Sie Rohre mit einem Gefrierbehälter schnell ein. Gehen Sie genauso mit dem gesunden Exemplar vor.
Für die Langfristige Lagerung lagern Sie alle Aliquotes in einem flüssigen Stickstofftank. Zellkultur. Schleifen Sie die Reste der Tumorgewebeverarbeitung, einschließlich der nekrotischen Portionen mit den Skalpellklingen so klein wie möglich.
Legen Sie ein Zellsieb an die Oberseite eines sterilen PP-Rohrs und aspirieren Sie die Suspension mit einer serologischen Pipette, um das Zellsieb zu passieren. Verwenden Sie den Kolben einer Einwegspritze, um die Gewebereste durch das Zellsieb zu drücken, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Spülen Sie mit PBS und wiederholen Sie diese Schritte, bis kein Material mehr vorhanden ist.
Entfernen Sie das Zellsieb und zentrieren Sie die Suspension bei 180 RCF für sieben Minuten. In der Zwischenzeit bereiten Sie eine kollagenvorbeschichtete Sechs-Well-Platte mit unterschiedlichen Medienzusammensetzungen vor, um die Wahrscheinlichkeit eines Tumorauswachsens zu erhöhen. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in PBS wieder auf und geben Sie 500 Mikroliter pro Brunnen aus.
Legen Sie die Platte anschließend in einen Standard-Inkubator. Generierung von patientenabgeleiteten Xenograft. Für die Erzeugung von vom Patienten abgeleiteten Xenografts bei immungeschwächten Mäusen sollten Tiere in einer spezifischen pathogenfreien Umgebung gehalten werden.
Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung, bestehend aus Peelings, Schürze, Gesichtsmaske, Haarschutz und Handschuhen. Nach der Organisation Ihres Arbeitsbereichs nehmen Sie die Wunschtumorprobe aus dem flüssigen Stickstoffbehälter. Füllen Sie ein frisches PP-Rohr mit 35ml PBS, waschen Sie dann den Auftauvorgang sorgfältig und kippen Sie das Kryorohr nach oben und unten.
Sobald der Inhalt schlammig wird, in die PBS gegossen und die Tumorstücke abspülen. Entsorgen Sie den Großteil der PBS und leeren Sie die Würfel in den Deckel. Legen Sie eine sterile Kunststoffschale auf eine Eispackung und fügen Sie ein Tröpfchen von 100 Mikroliter Matrigel hinzu.
Verwenden Sie Zangen, um die Tumorstücke in das Matrigel zu legen und den Tumor für 10 Minuten zu inkubieren. In der Zwischenzeit zwei Mäuse anästhesieren. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Fuß des Tieres kneifen.
Jede Bewegung deutet auf eine unzureichende Anästhesie hin und erfordert entweder einige Wartezeiten oder zusätzliche Dosierungen. Tragen Sie die Augensalbe auf, kneifen Sie die Maus am Hals und injizieren Sie einen Mikrochip subkutan. Führen Sie die folgenden Schritte parallel aus.
Desinfizieren Sie die Flanken der Mäuse und machen Sie einen kleinen Hautschnitt mit Streifen Metzenbaum Schere und bilden eine subkutane Tasche durch stumpfe Vorbereitung. Verwenden Sie anatomische Zangen, um die Tumorstücke einzufügen. Stellen Sie sicher, dass das Stück am hinteren Ende der Hauttasche platziert ist.
Den restlichen Matrigel ansaugen und gleichmäßig auf alle vier Taschen verteilen. Warten Sie auf die Aushärtung des Gels und schließen Sie die Haut mit Single-Button-Nähten, ohne die Tumorstücke mit der Nadel zu beschädigen. Schneiden Sie den Faden so kurz wie möglich über dem Knoten und wenden Sie Spray-Dressing an, um zu verhindern, dass die Nähte nicken.
Scannen Sie den Mikrochip und fügen Sie die Tumorinformationen zur späteren Identifizierung des Tieres in die Datenbank ein. Bereiten Sie einen Käfig mit frischer Bettwäsche und Nistmaterial vor, stellten Sie die Mäuse vor eine Infrarotlampe und überwachen Sie das Tier, bis die Anästhesie nachgelassen hat. Explantation von PDX.
Nachdem der PDX-Tumor die erforderliche Größe erreicht hat, wird die Maus durch CO2-Erstickung und anschließende Zervixdislokation eingeschläfert. Sezieren Sie die Haut vorsichtig vom Tumor und entfernen Sie den PDX vollständig. Repräsentative Ergebnisse.
Legen Sie einen Tumor auf eine sterile Kunststoffschale und verwenden Sie sterile Skalpellklingen für die Weiterverarbeitung. Loch mit den Scheiben schneiden, in eine Histologiekassette legen und in Formalin eintauchen, um paraffinierte Proben für eine histologische Beurteilung zu einem späteren Zeitpunkt zu erzeugen. Übertragen Sie den Rest des Tumors auf Gewebespeicherlösung und erstellen Sie neue vital erhaltene und schnappende gefrorene Proben für die Biobank.
Verwenden Sie außerdem die Reste des PDX-Tumors analog zur Kapitelzellkultur, um sekundäre Tumorzelllinien zu bestimmen. Um weitere PDX zu generieren, übertragen Sie zwei oder mehr Tumorstücke mit Matrigel auf eine neue Empfängermaus, wie zuvor gezeigt. Schlussfolgerung. Mit dem vorgestellten Protokoll konnten wir bisher neun Pankreas- und mehr als 100 kolorektal patientenabgeleitete Krebszelllinien sowie 19 Pankreas- und über 150 kolorektale PDX-Modelle etablieren.
