Creación y mantenimiento de un biobanco vivo cómo lo hacemos. Introducción. Los biobancos tradicionales comúnmente contienen muestras de tejido y sangre no viables. A pesar de reflejar adecuadamente la diversidad de poblaciones de pacientes con cáncer y permitir análisis genéticos e histológicos, no son adecuados para ensayos preclínicos que evalúan estrategias terapéuticas.
Un biobanco que integra también modelos derivados del paciente supera estas limitaciones. Lo que permite realizar pruebas funcionales para la medicina de precisión. Adquisición de muestras.
Para el biobanco de cáncer colorrectal y pancreático, elegir casos con diagnóstico probado, así como suficiente tamaño tumoral, el concentrante informado del paciente es obligatorio. Antes del inicio de la cirugía, extraiga 20 ml de sangre usando una jeringa heparinizada y 7,5 ml adicionales con una monovetta sérica. Procesamiento sérico y aislamiento PBL.
Después de la centrifugación a 1,128 RCF durante 15 minutos a cuatro grados, el suero se acuestó en un criotubo preetiquetado y se sumerge directamente en nitrógeno líquido. La sangre heparinizada se transfiere a un tubo de polipropileno y se diluye con 15 ml de PBS. Utilice una pipeta serológica para matar lentamente la mezcla con 15 ml de Pancoll.
Después de la centrifugación del gradiente de densidad, la capa opaca que contiene las células mononucleares se toma con una pipeta serológica y se transfiere a un nuevo tubo PP. Después de lavar con PBS y peletizar las células mononucleares por centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspend el pellet en medio congelador y prescinda en criotubos preetiquetados. Transfiera los tubos a un recipiente de refrigeración adecuado para una congelación lenta con un grado por minuto y almacene temporalmente a 80 grados.
Procesamiento de tejidos. Tan pronto como la muestra de tejido sea resecada por el cirujano, colórala en un recipiente adecuado. Evite bajo todas las circunstancias que el tejido esté cubierto de formalina.
Transporte lo más rápido posible a la patología para la escisión del material tumoral no relevante para la evaluación patológica de los márgenes de resección. La pieza tumoral debe manejarse lo más aséptica posible. Además, obtener una muestra de tejido sano y colocar ambos en tubos separados rellenados previamente con solución de almacenamiento de tejidos en el hielo.
Regrese inmediatamente al laboratorio para iniciar el procesamiento de tejidos en condiciones estériles. La pieza de tejido se coloca en un plato de plástico estéril lleno de solución de almacenamiento de tejidos para evitar la desecación. En primer lugar, excisa una o más piezas del tamaño de un cabezal de alfiler para congelarse a presión dependiendo del tamaño de la muestra de tejido obtenida.
Coloque el tejido nativo en criotubos preetiquetados y sumérjalo inmediatamente en nitrógeno líquido. Cortar el tejido restante en cubos de tres por tres por tres milímetros cúbicos. Tenga en cuenta que el tejido necrótico debe diseccionarse por completo, pero no debe desecharse.
Organice los cubos en cuatrillizos para determinar el número de alícuotas para un almacenamiento vital. Etiquete un número adecuado de criotubos y precaréntelos con un medio congelador de 1,5 ml cada uno. Dado que el DMSO en el medio congelador es citotóxico, realizó los siguientes pasos rápidamente y sin interrupción.
Utilice una hoja de bisturí para recoger cuatro piezas de tejido por tubo. Asegúrese de que todas las piezas estén sumergidas completamente en el medio congelador idealmente en la parte inferior del tubo y congele rápidamente los tubos utilizando un recipiente congelador. Proceda de la misma manera con la muestra sana.
Para almacenamiento a largo plazo, almacene todos los aliquesas en un tanque de nitrógeno líquido. cultivo celular. Moler los restos del procesamiento del tejido tumoral, incluidas las porciones necróticas con las cuchillas del bisturí lo más pequeñas posible.
Coloque un colador de células en la parte superior de un tubo PP estéril y aspire la suspensión con una pipeta serológica para pasar a través del colador celular. Utilice el émbolo de una jeringa de un solo uso para presionar los restos de tejido a través del colador celular para generar una sola suspensión celular. Enjuague con PBS y repita estos pasos hasta que no quede material.
Retire el colador de células y centrífuga la suspensión a 180 RCF durante siete minutos. Mientras tanto, prepara una placa de seis pozos precubierta de colágeno con diferentes composiciones mediáticas para aumentar la probabilidad de crecimiento tumoral. Deseche el sobrenadante y vuelva a gastar el pellet en PBS y dispense 500 microlitros por pozo.
Después, coloque la placa en una incubadora estándar. Generación de xenoinjerto derivado del paciente. Para la generación de xenoinjertos derivados del paciente en ratones inmunocomprometidos, los animales deben mantenerse en un entorno específico libre de patógenos.
Use equipo de protección personal compuesto por exfoliantes, delantal, máscara facial, cubierta para el cabello y guantes. Después de organizar el espacio de trabajo, tome la muestra tumoral del deseo del recipiente de nitrógeno líquido. Llene un tubo PP fresco con 35ml PBS y luego lave el proceso de descongelación cuidadosamente e incline el tubo crio hacia arriba y hacia abajo.
Tan pronto como el contenido se vuelve desaliñado, vertido en el PBS y enjuagar las piezas del tumor. Deseche la mayoría del PBS y vacíe los cubos en la tapa. Coloque un plato de plástico estéril en una bolsa de hielo y agregue una gota de 100 microlitros Matrigel.
Utilice fórceps para colocar las piezas tumorales en el Matrigel e incubar el tumor durante 10 minutos. Mientras tanto, anestesia a dos ratones. Compruebe la profundidad de la anestesia pellizcando el pie del animal.
Cualquier movimiento indica anestesia insuficiente y requiere alguna espera o dosificación adicional. Aplique ungüento ocular, pellizque el ratón por el cuello e inyecte un microchip por vía subcutánea. Realice los siguientes pasos en paralelo.
Desinfectar los flancos de los ratones y hacer una pequeña incisión de la piel con tijeras Metzenbaum de rayas y formar un bolsillo subcutáneo por preparación contundente. Utilice fórceps anatómicos para insertar las piezas tumorales. Asegúrese de que la pieza se coloca en el extremo trasero del bolsillo de la piel.
Aspirar el Matrigel restante y distribuir por igual a los cuatro bolsillos. Espere el curado del gel y cierre la piel con suturas de un solo botón sin dañar las piezas tumorales con la aguja. Corte la rosca lo más corta posible por encima del nudo y aplique apósito en aerosol para evitar que no se presenten las suturas.
Escanee el microchip y agregue la información del tumor a la base de datos para su posterior identificación del animal. Preparar una jaula con ropa de cama fresca y material de anidación, colocar los ratones delante de una lámpara infrarroja y monitorear al animal hasta que la anestesia haya disminuido. Explantación de PDX.
Después de que el tumor PDX ha alcanzado el tamaño requerido, el ratón es eutanasiado por asfixia de CO2 y posterior dislocación cervical. Disecciona cuidadosamente la piel del tumor y elimina la PDX por completo. Resultados representativos.
Coloque un tumor en una platillo de plástico estéril y use cuchillas estériles del bisturí para su posterior procesamiento. Cortar agujero con las rodajas, colocarlos en un casete de histología y sumergirse en formalina para generar espécimen incrustado de parafina para su evaluación histológica en un momento posterior. Transfiera el resto del tumor a la solución de almacenamiento de tejidos y cree una nueva muestra congelada vitalmente conservada y a presión para el biobanco.
Además, utilice los restos del tumor PDX análogos al cultivo celular capitular para establecer líneas celulares tumorales secundarias. Para generar más PDX, transfiera dos o más piezas tumorales con Matrigel a un nuevo ratón receptor como se muestra anteriormente. conclusión. A través del protocolo presentado, hasta ahora logramos establecer nueve líneas celulares cancerosas pancreáticas y más de 100 colorrectal derivadas del paciente, así como 19 modelos DEP pancreáticos y más de 150 colorrectal.
