Création et entretien d’une biobanque vivante comment nous le faisons. Introduction. Les biobanques traditionnelles contiennent généralement des échantillons de tissus et de sang non viables. Bien qu’ils reflètent adéquatement la diversité des populations de patients atteints de cancer et qu’ils permettent des analyses génétiques et histologiques, ils ne conviennent pas aux essais précliniques évaluant les stratégies thérapeutiques.
Une biobanque intégrant également des modèles dérivés du patient surmonte ces limitations. Permettant ainsi des tests fonctionnels pour la médecine de précision. Exemple d’acquisition.
Pour le biobancaire du cancer colorectal et pancréatique, élire des cas avec le diagnostic prouvé aussi bien que la taille suffisante de tumeur, concent informé du patient est obligatoire. Avant le début de la chirurgie, tirer 20ml de sang à l’aide d’une seringue héparinée et 7,5ml supplémentaires avec une monovette sérique. Traitement sérique et isolement PBL.
Après centrifugation à 1 128 RCF pendant 15 minutes à quatre degrés, le sérum est aliquoted dans un cryotube pré-étiqueté et directement immergé dans de l’azote liquide. Le sang héparinisé est transféré dans un tube de polypropylène et dilué avec 15ml de PBS. Utilisez une pipette sérologique pour sous-coucher lentement le mélange avec 15ml Pancoll.
Après centrifugation du gradient de densité, la couche opaque contenant les cellules mononucléaires est prise avec une pipette sérologique et transférée dans un nouveau tube PP. Après lavage avec PBS et pelletage des cellules mononucléaires par centrifugation, jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans le milieu du congélateur et distribuer dans des cryotubes pré-étiquetés. Transférer les tubes dans un récipient de refroidissement adapté au gel lent avec un degré par minute et conserver temporairement à 80 degrés.
Traitement des tissus. Dès que le spécimen de tissu est réséqué par le chirurgien, mettez-le dans un récipient approprié. Évitez en toutes circonstances que le tissu soit recouvert de formaline.
Transport aussi vite que possible à la pathologie pour l’excision du matériel de tumeur non pertinent pour l’évaluation pathologique des marges de résection. La pièce tumorale doit être manipulée aussi aseptique que possible. En outre, obtenir un spécimen de tissu sain et placer les deux dans des tubes séparés pré-remplis avec la solution de stockage des tissus sur la glace.
Retournez immédiatement au laboratoire pour commencer le traitement des tissus dans des conditions stériles. Le morceau de tissu est placé sur un plat en plastique stérile rempli de solution de stockage des tissus pour éviter la dessiccation. Tout d’abord, exciser une ou plusieurs pièces de la taille d’une tête d’épingle pour obtenir une congélation en fonction de la taille de l’échantillon de tissu obtenu.
Placez le tissu indigène dans des cryotubes pré-étiquetés et plongez immédiatement dans de l’azote liquide. Couper le reste du tissu en cubes de trois par trois par trois millimètres cubes. Tenir compte du fait que les tissus nécrotiques doivent être complètement disséqués, mais ne doivent pas être jetés.
Disposer les cubes en quadruplés pour déterminer le nombre d’aliquots pour le stockage vital. Étiquetez un nombre suffisant de cryotubes et remplissez-les à l’œlire d’un milieu de congélation de 1,5 ml chacun. Puisque le DMSO dans le milieu de congélateur est cytotoxique, a exécuté les étapes suivantes rapidement et sans interruption.
Utilisez une lame de scalpel pour ramasser quatre morceaux de tissu par tube. Assurez-vous que tous les morceaux sont complètement immergés dans le congélateur moyen idéalement au fond du tube et congelez rapidement les tubes à l’aide d’un contenant de congélation. Procéder de la même manière avec le spécimen sain.
Pour le stockage à long terme, conserver tous les aliquotes dans un réservoir d’azote liquide. Culture cellulaire. Moudre les restes du traitement des tissus tumoraux, y compris les parties nécrotiques avec les lames de scalpel aussi petit que possible.
Placez une passoire cellulaire au sommet d’un tube PP stérilisé et aspirez la suspension avec une pipette sérologique pour passer à travers la passoire cellulaire. Utilisez le piston d’une seringue à usage unique pour appuyer sur les restes de tissu à travers la passoire cellulaire pour générer une suspension cellulaire unique. Rincer à l’aide de PBS et répéter ces étapes jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de matériau.
Retirer la passoire cellulaire et centrifuger la suspension à 180 RCF pendant sept minutes. En attendant, préparez une plaque pré-enduite de collagène de six puits avec différentes compositions de médias pour augmenter la probabilité de croissance de tumeur. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille dans PBS et distribuez 500 microlitres par puits.
Ensuite, placez la plaque dans un incubateur standard. Génération de xénogreffe dérivée du patient. Pour la génération de xénogreffes dérivées du patient chez les souris immunocompromisées, les animaux doivent être gardés dans un environnement spécifique exempt d’agents pathogènes.
Portez de l’équipement de protection individuelle composé de gommages, tablier, masque facial, housse de cheveux et gants. Après avoir organisé votre espace de travail, prenez le spécimen de tumeur de désir du récipient liquide d’azote. Remplissez un tube PP frais avec 35ml PBS puis lavez soigneusement le processus de décongélation et inclinez le tube cryo de haut en bas.
Dès que le contenu devient slushy, versé dans le PBS et rincer les morceaux de tumeur. Jeter la majorité du PBS et vider les cubes dans le couvercle. Déposer un plat en plastique stérile sur un sac de glace et ajouter une gouttelette de 100 microlitres Matrigel.
Utilisez des forceps pour placer les morceaux de tumeur dans le Matrigel et incuber la tumeur pendant 10 minutes. En attendant, anesthésier deux souris. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en pinçant le pied de l’animal.
Tout mouvement indique une anesthésie insuffisante et nécessite soit une certaine attente ou un dosage supplémentaire. Appliquer l’onguent pour les yeux, pincer la souris par le cou et injecter une micropuce sous-cutanée. Effectuez les étapes suivantes en parallèle.
Désinfecter les flancs des souris et faire une petite incision cutanée avec des ciseaux Metzenbaum rayé et former une poche sous-cutanée par préparation émoussée. Utilisez des forceps anatomiques pour insérer les morceaux de tumeur. Assurez-vous que la pièce est placée à l’arrière de la poche de la peau.
Aspirer le Matrigel restant et répartir également dans les quatre poches. Attendez le durcissement du gel et fermez la peau avec des sutures à bouton unique sans endommager les morceaux de tumeur avec l’aiguille. Couper le fil aussi court que possible au-dessus du nœud et appliquer un pansement de pulvérisation pour empêcher l’exaison des sutures.
Scannez la puce et ajoutez l’information sur la tumeur à la base de données pour une identification ultérieure de l’animal. Préparer une cage avec de la literie fraîche et du matériel de nidification, placer les souris devant une lampe infrarouge et surveiller l’animal jusqu’à ce que l’anesthésie se soit calmée. Explantation de PDX.
Après que la tumeur de PDX ait atteint la taille exigée, la souris est euthanasiée par asphyxie de CO2 et dislocation cervicale suivante. Disséquer soigneusement la peau de la tumeur et enlever complètement le PDX. Résultats représentatifs.
Placez une tumeur sur un plat en plastique stérile et utilisez des lames stériles de scalpel pour un traitement ultérieur. Couper le trou avec les tranches, les placer dans une cassette d’histologie et plonger dans la formaline pour générer de la paraffine spécimen incorporé pour l’évaluation histologique à un moment ultérieur. Transférer le reste de la tumeur à la solution de stockage des tissus et de créer de nouveaux spécimens congelés conservés de façon vitale et snap pour la biobanque.
En outre, utilisez les restes de la tumeur pdx analogue à la culture cellulaire chapitre pour établir des lignées cellulaires tumorales secondaires. Pour générer d’autres PDX, transférez deux morceaux de tumeur ou plus avec Matrigel à une nouvelle souris destinataire comme indiqué précédemment. conclusion. Au moyen du protocole présenté, nous avons jusqu’ici réussi à établir neuf lignées pancréatiques et plus de 100 lignées côlorectals de cellules cancéreuses patient-dérivées, aussi bien que 19 modèles pancréatiques et plus de 150 modèles côlorectaux de PDX.
