我们提出了一种使用人工核酸转录因子调节聚合酶活性的方法。这种基因调控架构可以作为未来体外遗传装置的基石。通过将DNA结合域与T7 RNA聚合酶相关联，该技术将基于DNA的电路的可扩展性与转录电路的功能相结合。
首先将9个稀释的单链BG寡核苷酸稀释到最终体积为50微升的双蒸馏水，比例从5到1到1到5，如表中所示。通过将两微升SNAP缓冲液与四微升BG寡核苷酸和四微升SNAP T7 RNAP混合，为每个稀释液制备一个反应混合物。通过用双蒸馏水代替寡核苷酸来制备RNAP对照，并通过用双蒸馏水代替SNAP T7 RNAP来制备DNA对照。
通过将每个样品的2微升加入4微升的SNAP缓冲液和每个样品的2微升蛋白质上样染料来设置11个反应。在70摄氏度下加热反应10分钟，然后将每个样品的两微升加载到4至12%的玻璃体蛋白质凝胶上，在200伏的冰上进行35分钟的凝胶电泳。在运行结束时，用三次水交换在摇床上洗涤凝胶，每次洗涤至少10分钟，然后用菁染料进行核酸染色15分钟。
在适当的凝胶成像系统上对凝胶进行成像，并用20毫升考马斯蓝再次染色凝胶。一小时后，用双蒸馏水去污至少一小时，然后再对凝胶进行成像。对于寡核苷酸系留的SNAP T7纯化，首先，通过将50微升一摩尔痕量，与100微升五摩尔氯化钠，与850微升双蒸馏水混合，制备洗脱缓冲液。
接下来，将每个样品的一个离子交换柱放入单独的两毫升离心管中，并通过离心用纯化缓冲液洗涤色谱柱，直到所有缓冲液都从每个色谱柱中洗脱出来。用纯化缓冲液以三比一纯化缓冲液与样品的比例稀释每个样品，并将400微升样品倒入每个色谱柱中。当所有缓冲液都已洗脱后，如图所示，收集并标记每个样品的流经。
每次洗涤时用400微升纯化缓冲液洗涤色谱柱三次，直到每次洗涤所有缓冲液都洗脱，并根据需要收集和标记流经物。最后一次洗涤后，通过将50微升洗脱缓冲液加入柱中心并离心柱三次直到所有50微升缓冲液洗脱出来，收集洗脱的蛋白质。每次离心后收集并标记洗脱液，在最后一次离心后将洗脱液池入单个管中，同时留下少量每个洗脱用于凝胶分析。
在260和280纳米处测量剩余洗脱等分试样的吸光度，并以一比一的比例向样品中加入甘油，以储存零下20度，直到使用。使用500微升30千尔顿离心过滤单元缓冲液，用2x储存缓冲液交换总洗脱产物。并测量吸光度，如图所示。
然后以一比一的比例向产品中加入甘油，以储存零下20摄氏度。要通过SDS-PAGE评估洗脱，请在4%至12%的玻璃体凝胶上以适当的蛋白质分子量标准品在200伏电压下运行样品35分钟，或直到染料前部迁移到凝胶末端。为了证明系留RNAP的按需控制活性，将每个模板的2.4微升与5微升5x退火缓冲液和14.2微升双蒸馏水混合。
将得到的一个微摩尔双链DNA CAGE在75摄氏度下孵育两分钟。并以与表中所示相同的方式退火启动子和孔雀石绿色适配体DNA模板的感官和反感官菌株。在孵育结束时，将系留的SNAP T7 RNAP以1至5摩尔比加入双链DNA CAGE中，最终浓度为500纳摩尔RNAP。
在室温下15分钟后，将样品放在冰上，并将2.5微升10x体外转录缓冲液与1微升25毫摩尔核糖核苷三磷酸盐，1微升1毫摩尔孔雀石绿，2.5微升RNAP CAGE混合物，2.5微升一个微摩尔转录因子A和B寡核苷酸链， 和三微升的一毫摩尔孔雀石绿色适配子模板在10微升双蒸馏水中。在15微升双蒸馏水中，建立含有2.5微升10x体外转录缓冲液，一微升25毫摩尔核糖核苷三磷酸混合物，一微升一微升1毫摩尔孔雀石绿，2.5微升RNAP CAGE混合物和三微升一毫摩尔孔雀石绿色适配子模板的第二反应。为了建立仅含有缓冲液的反应，在17.5微升双蒸馏水中混合2.5微升10x体外转录缓冲液，一微升25毫摩尔核糖苷三磷酸混合物，一微升一毫摩尔孔雀石绿和三微升一毫摩尔孔雀石绿色适配体模板。
当所有反应都准备好后，将每个反应转移到384孔板中，并在荧光板读数仪上监测孔雀石绿色适配子转录两小时，在37摄氏度下以610纳米激发和655纳米发射。在读数结束时，将板放在冰上，并将RNA产物在变性12%TBE聚丙烯酸凝胶中，在70摄氏度TBE缓冲液中以280伏特运行20分钟，或直到染料前端到达凝胶的末端。然后，在眼眶振荡器上用菁染料核酸染色凝胶10分钟，然后成像，如图所示。
重组 SNAP T7 RNAP 蛋白的成功表达和纯化可以使用 SDS-PAGE 进行确认。在SDS-PAGE之后，酶活性可以通过体外转录反应来验证。BG官能化寡核苷酸的成功偶联可以通过18%变性TBE-尿素PAGE进行验证。
与未修饰的寡核苷酸相比，将BG部分添加到寡核苷酸中会增加其分子量。正如在该具有代表性的菁染染料染色凝胶中观察到的，以确认从过量的BG寡核苷酸中纯化DNA系留的T7 RNAP，初始流经部分主要含有过量的BG寡核苷酸，以及一小部分未与阳离子交换树脂结合的DNA系留聚合酶。池稀释级分仅含有由菁染料与寡核苷酸系绳结合引起的RNAP寡核苷酸单条带，上浓缩产物泳道表现出相同但较暗的条带，表示成功的上调浓度。
通过考马斯蓝染色观察到相同的模式，在非偶联RNAP对照中观察到小的凝胶迁移率变化。在这里，在体外转录结束时产生的荧光信号被实时动力学显示。在该分析中，观察到荧光信号中336倍的活化，证明了对聚合酶活性的稳健控制。
尝试此方案时，请记住在核酸染色之前彻底洗涤凝胶上的SDS。这是因为STS会将染料捕获在凝胶中，从而导致高背景信号。将我们的方法应用于具有多个级联的大型基因回路将展示系留转录系统的可扩展性和可组合性。
该技术目前正被用于开发能够进行神经网络样式计算的基因电路。
