我们的实验方案描述了制造和分析3D人骨骼肌微组织培养物的详细方法。肌肉微组织可以应用于基础肌肉生物学，疾病建模或候选分子测试的研究。该技术的主要优点是它允许对收缩力和钙瞬变进行原位评估。
因此，您可以对肌肉组织功能进行纵向研究。演示该程序的将是Brennen Musgrave和Heta Lad，他们来自我的实验室。在细胞接种前两到三小时，将六孔温和的策略板部分放入10厘米的细胞培养皿中。
通过加入100微升5%多聚体F-127溶液来制备每个单独的肌细胞培养物。使用盖子盖住孔，并涂上石蜡膜以密封盘子。在装有板式旋转适配器的离心机中以1， 550 g离心一分钟。
将培养皿储存在四摄氏度，直到细胞准备好接种。然后在培养罩中的冰上缓慢解冻150微升等分试样的基底膜提取物和110微升凝血酶等分试样。在细胞培养罩中工作，将700微升0.9%盐水溶液加入含有7毫克纤维蛋白原粉末的1.5毫升微量离心管中。
将试管置于37摄氏度的细胞培养箱中三到五分钟，而不会涡旋。取出并轻轻拂管，然后在微量离心机中脉冲旋转溶解的溶液，然后将其返回培养罩。使用配备0.22微米注射器过滤器的一毫升注射器过滤纤维蛋白原溶液。
然后将溶解的纤维蛋白原溶液转移到基底膜提取物和凝血酶等分试样的冰中。准备并在37摄氏度下预热组织生长培养基，在接种组织后将其引入培养井。从培养箱中取出细胞培养板并吸出培养基。
然后通过在每个培养板中加入五毫升DPBS来洗涤细胞一次。吸出DPBS并通过在每个培养皿中加入一毫升0.25%胰蛋白酶EDTA来分离细胞。将板置于细胞培养箱中三分钟，通过向培养皿中加入三毫升洗涤培养基来保持胰蛋白酶，然后将细胞转移到适当大小的锥形管中。
通过以400倍G离心10分钟来沉淀细胞。小心地吸出培养基而不损坏细胞沉淀，然后将细胞重新悬浮在一毫升洗涤培养基中。在明场显微镜下使用血细胞计数器和台盼蓝染料计数细胞。
为了播种六个组织，为八个组织准备足够的细胞和细胞外基质，从而考虑损失和气泡形成。将120万个细胞转移到新的锥形管中，然后用洗涤介质将体积增加到10毫米。通过以400倍G离心10分钟来沉淀细胞。
在1.5毫升的微型离心管中制备150微升ECM混合物，并将混合物储存在冰上直至使用。从含有细胞的锥形管中吸出培养基，注意避免细胞沉淀。用戴着手套的手指用力轻拂管的末端，直到沉淀显示为细胞浆液。
将120微升的ECM溶液转移到含有细胞浆液的管中，并小心地上下移液以完全重新悬浮ECM内的细胞以产生单个细胞悬浮液。避免产生气泡，然后将细胞ECM悬浮液放在冰上直到使用。将含有肌细胞培养罩内的冰袋顶部的10厘米冷藏皿放在细胞培养罩内的冰袋上，并从每个孔中吸出多聚体F-127溶液。
让残留的多质F-127溶液从多孔PDMS中释放出来，并通过让孔在冰上静置五分钟，然后再次吸出而沉降到井底。小心地移取细胞ECM悬浮液以重新悬浮细胞，然后通过抓住靠近顶部的1.5毫升将105微升悬浮液转移到新鲜的，预冷的1.5毫升管中。向105微升细胞ECM悬浮液中加入0.84微升每毫升凝血酶储备溶液100单位。
快速彻底地移液混合，避免引入气泡。向每个孔中加入15微升细胞ECM混合物，而无需将移液器压入孔的底部。通过两个轻动作，将细胞悬浮液散布在孔中每个柱子后面。
将盖子放在10厘米培养板上，并将其转移到37摄氏度的组织培养箱中约5分钟。在细胞ECM混合物聚合后，向每个肌钾孔中加入200微升预热的组织生长培养基。盖上10厘米培养皿的盖子，并将其保存在培养箱中，直到分化。
在14天的培养期间，成肌细胞通过在温和的策略井中自组织来显示天然组织的各个方面，以形成具有多核横纹肌管的3D微组织。肌管具有肌节条纹，通过肉瘤α肌动蛋白的免疫染色来可视化。为了实现井面管的排列，应避免技术错误，例如移液时形成气泡，或在抽吸过程中损坏浮滤膜。
这里显示了肌细胞孔板柱响应于低频和高频电刺激的代表性位移，表明肌管对不同的电刺激做出反应并相应地收缩。置换后定量允许将HMMT转换为绝对收缩力.还分析了由GCaMP6转导的成肌细胞制成的HMMT上的钙瞬变，以响应低频和高频刺激。
荧光强度的定量可用作HMMT钙处理特性的测量。大多数第一次进行这种组织接种的人，在将细胞细胞外基质添加到孔中以及形成气泡时都会遇到困难。我们建议在第一次尝试细胞之前，在一些备用的微组织培养井上用非常简单的粘性溶液练习该技术。
