Il nostro protocollo descrive metodi dettagliati per fabbricare e analizzare una coltura di microtessuto del muscolo scheletrico umano 3D. I microtessuti muscolari possono essere applicati a studi di biologia muscolare di base, modelli di malattie o per test di molecole candidate. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la valutazione in situ della forza contrattile e dei transitori di calcio.
Per questo motivo, è possibile condurre studi longitudinali sulla funzione del tessuto muscolare. A dimostrare la procedura saranno Brennen Musgrave e Heta Lad, studenti laureati del mio laboratorio. Due o tre ore prima della semina cellulare, posizionare una porzione di piastra tattica di sei pozzi in un piatto di coltura cellulare di 10 centimetri.
Preparare bene ogni singola coltura miotattica aggiungendo 100 microlitri di una soluzione F-127 pluronica al 5%. Utilizzare il coperchio per coprire i pozzetti e applicare un film di paraffina per sigillare il piatto. Centrifugare il piatto a 1.550 volte G per un minuto in una centrifuga dotata di un adattatore per spinner a piastre.
Conservare il piatto di coltura a quattro gradi Celsius fino a quando le cellule sono pronte per la semina. Quindi scongelare lentamente 150 aliquote di microlitro di estratto di membrana basale e 110 aliquote di microlitro di trombina sul ghiaccio nella cappa di coltura. Lavorando nella cappa di coltura cellulare, aggiungere 700 microlitri di soluzione salina allo 0,9% a un tubo di microcentrifera da 1,5 millilitri contenente sette milligrammi di fibrinogeno in polvere.
Posizionare il tubo in un incubatore di colture cellulari a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti senza vortice. Rimuovere e far scorrere delicatamente il tubo, quindi ruotare la soluzione disciolta in una micro centrifuga prima di restituirla alla cappa di coltura. Filtrare la soluzione di fibrinogeno utilizzando una siringa da un millilitro dotata di un filtro a siringa da 0,22 micrometri.
Quindi trasferire la soluzione di fibrinogeno disciolto sul ghiaccio insieme all'estratto di membrana basale e alle aliquote di trombina. Preparare e preriscaldare il mezzo di crescita tissutale a 37 gradi Celsius, che verrà introdotto nei pozzetti di coltura dopo aver seminato i tessuti. Rimuovere le piastre di coltura cellulare dall'incubatore e aspirare il terreno di coltura.
Quindi lavare le cellule una volta aggiungendo cinque millilitri di DPBS in ogni piastra di coltura. Aspirare il DPBS e staccare le cellule aggiungendo un millilitro di 0,25% di tripsina EDTA in ogni piatto di coltura. Posizionare la piastra nell'incubatore di colture cellulari per tre minuti, tenere la tripsina aggiungendo tre millilitri di mezzo di lavaggio al piatto di coltura, quindi trasferire le cellule in un tubo conico di dimensioni appropriate.
Pellet le celle centrifugando a 400 volte G per 10 minuti. Aspirare accuratamente il fluido senza danneggiare il pellet cellulare, quindi sospendere nuovamente le celle in un millilitro del mezzo di lavaggio. Contare le cellule usando un emocitometro e un colorante blu di tripano sotto microscopia a campo luminoso.
Per seminare sei tessuti, preparare abbastanza cellule e matrice extracellulare per otto tessuti, tenendo così conto delle perdite e della formazione di bolle. Trasferire 1,2 milioni di celle in un nuovo tubo conico, quindi aumentare il volume a 10 millimetri con il mezzo di lavaggio. Pellet le celle centrifugando a 400 volte G per 10 minuti.
Preparare 150 microlitri di miscela ECM in un tubo microcentrifiva da 1,5 millilitri e conservare la miscela su ghiaccio fino all'uso. Aspirare il mezzo dal tubo conico contenente le cellule, avendo cura di evitare il pellet cellulare. Far scorrere vigorosamente l'estremità del tubo con un dito guantato fino a quando il pellet appare come un impasto cellulare.
Trasferire 120 microlitri della soluzione ECM al tubo contenente il liquame cellulare e pipettare con cura su e giù per sospendere completamente le celle all'interno dell'ECM per generare una sospensione a cella singola. Evitare di creare bolle, quindi posizionare la sospensione ECM cellulare sul ghiaccio fino all'uso. Posizionare la capsula refrigerata da 10 centimetri contenente i pozzetti miotattici sopra un impacco di ghiaccio all'interno della cappa di coltura cellulare e aspirare la soluzione pluronica F-127 da ciascun pozzetto.
Lasciare che la soluzione pluronica residua di F-127 si rilasci dal PDMS poroso e depositarsi sul fondo del pozzo lasciando riposare i pozzetti per cinque minuti sul ghiaccio, quindi aspirare di nuovo. Pipettare con cura la sospensione ECM della cella per ri-sospendere le celle, quindi trasferire 105 microlitri della sospensione in un tubo fresco pre-refrigerato da 1,5 millilitri afferrandolo vicino alla parte superiore. Aggiungere 0,84 microlitri di 100 unità per millilitro di trombina soluzione madre ai 105 microlitri della sospensione ECM cellulare.
Pipetta rapidamente e accuratamente per mescolare, evitando l'introduzione di bolle. Aggiungere 15 microlitri della miscela ECM cellulare a ciascun pozzetto senza premere la pipetta sul fondo del pozzo. Con due movimenti leggeri, stendete la sospensione cellulare dietro ogni palo nel pozzo.
Posizionare il coperchio sulla piastra di coltura da 10 centimetri e trasferirlo in un incubatore di colture tissutali a 37 gradi Celsius per circa cinque minuti. Aggiungere 200 microlitri di mezzi di crescita tissutali preriscaldati a ciascun pozzo miotattico dopo che la miscela ECM cellulare ha polimerizzato. Sostituire il coperchio sul piatto da 10 centimetri e tenerlo nell'incubatrice fino alla differenziazione.
Durante un periodo di coltura di 14 giorni, i mioblasti hanno mostrato gli aspetti del tessuto nativo auto-organizzandosi nel pozzo tattico mite per formare una microtessuta 3D con miotubi striati multi-nucleati. I miotubi hanno striature sarcomere, che sono state visualizzate mediante immunocolorazione per alfa actinina sarcomerica. Per ottenere miotubi ben allineati, è necessario evitare errori tecnici come la formazione di bolle durante il pipettaggio o il rivestimento pluronico dannoso durante l'aspirazione.
Uno spostamento rappresentativo del palo della piastra del pozzo miotattico in risposta alla stimolazione elettrica a bassa e alta frequenza, è mostrato qui, indicando che i miotubi rispondono a stimoli elettrici variabili e si contraggono di conseguenza. La quantificazione del post spostamento consente la conversione in forza contrattile assoluta degli HMMT. La transitorietà del calcio sugli HMMT realizzati con mioblasti trasdotti GCaMP6 è stata analizzata anche in risposta alla stimolazione a bassa e alta frequenza.
La quantificazione dell'intensità fluorescente può essere utilizzata come misura per le proprietà di manipolazione del calcio degli HMMT. La maggior parte delle persone che eseguono questa semina tissutale per la prima volta, lottano con l'aggiunta della matrice extracellulare cellulare ai pozzetti e con la formazione di bolle. Si consiglia di praticare la tecnica su alcuni pozzetti di coltura di microtessuta di riserva con una soluzione viscosa molto semplice prima del primo tentativo con le cellule.
