我々のプロトコルは、3Dヒト骨格筋微小組織培養を製造し、分析するための詳細な方法を記述する。筋肉のマイクロ組織は、基本的な筋肉生物学、疾患モデリング、または候補分子検査の研究に適用することができます。この技術の主な利点は、収縮力とカルシウム過渡性のその場での評価を可能にすることです。
このため, 筋肉組織機能の縦方向の研究を行うことができます。.この手順を実証するには、私の研究室の大学院生であるブレネン・マスグレイブとヘタ・ラッドです。細胞播種の2〜3時間前に、6つのマイルドな戦術板部分を10センチメートルの細胞培養皿に入れる。
5%pluronic F-127溶液の100マイクロリットルを加えることによって、個々の筋戦術培養を十分に準備します。ふたを使って井戸を覆い、パラフィンフィルムを塗布して皿を密封します。プレートスピナーアダプターを装備した遠心分離機で1、550倍Gで料理を遠心分離します。
細胞が播種の準備ができるまで、培養皿を摂氏4度で保管します。次いで、基膜抽出物の150マイクロリットルアリコートをゆっくりと解凍し、培養フード内の氷上のトロンビンの110マイクロリットルアリコートを解凍する。細胞培養フードで働き、7ミリグラムの粉末フィブリノーゲンを含む1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に0.9%生理食塩水の700マイクロリットルを加えます。
37°Cの細胞培養インキュベーターに、渦を出さずに3~5分間チューブを入れます。チューブを取り外して軽くフリックし、溶解した溶液をマイクロ遠心分離機でパルス回転させてから培養フードに戻します。0.22マイクロメートルのシリンジフィルターを装備した1ミリリットルのシリンジを使用してフィブリノーゲン溶液をフィルターします。
次に、溶存したフィブリノーゲン溶液を基膜抽出物およびトロンビンアリコートと共に氷に移す。組織を播種した後に培養井戸に導入される37°Cで組織成長培地を準備し、予め温めます。培養器から細胞培養プレートを取り出し、培養培地を吸引する。
次に、各培養プレートに5ミリリットルのDPBSを加えて細胞を1回洗浄します。DPBSを吸引し、各培養皿に0.25%トリプシンEDTAの1ミリリットルを加えることによって細胞を取り外す。プレートを細胞培養インキュベーターに3分間置き、培養皿に3ミリリットルの洗浄媒体を加えてトリプシンを保持し、細胞を適切なサイズの円錐形チューブに移す。
ペレットは、Gを400回Gで10分間遠心して細胞をペレット化した。細胞ペレットを損傷することなく慎重に培地を吸引し、その後、洗浄媒体の1ミリリットルで細胞を再懸濁する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、明視野顕微鏡下で青色の色素を試してみてください。
6つの組織を播種するには、8つの組織に十分な細胞と細胞外マトリックスを調製し、損失と気泡形成を考慮します。120万個の細胞を新しい円錐形チューブに移し、洗浄媒体で体積を10ミリメートルに増やします。ペレットは、Gを400回Gで10分間遠心して細胞をペレット化した。
1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに150マイクロECM混合物を調製し、使用するまで氷の上に保存します。細胞を含む円錐管から培地を吸引し、細胞ペレットを避けるように注意する。ペレットが細胞のスラリーとして現れるまで、手袋をした指でチューブの端部を激しくフリックします。
120マイクロリットルのECM溶液を細胞スラリーを含むチューブに移し、慎重にピペットを上下にしてECM内の細胞を完全に再中断し、単一の細胞懸濁液を生成する。泡を作成しないようにし、使用するまで氷の上に細胞ECM懸濁液を置きます。細胞培養フードの中のアイスパックの上にミオチックウェルを含む冷蔵10センチメートル皿を置き、各ウェルからpluronic F-127溶液を吸引する。
残留pluronic F-127溶液が多孔質PDMSから放出されるようにし、井戸を氷の上に5分間座らせてから再び吸引することによって井戸の底に落ち着きます。細胞ECM懸濁液を慎重にピペットして細胞を再懸濁し、105マイクロリットルの懸濁液を上に近づけて新鮮な冷蔵1.5ミリリットルチューブに移します。105マイクロリットルのセルECM懸濁液に、1ミリリットルのトロンビンストック溶液あたり0.84マイクロリットルを加えます。
ピペットは、泡の導入を避け、迅速かつ徹底的に混合する。ピペットをウェルの底に押し込まずに、細胞ECM混合物の15マイクロリットルを各ウェルに加えます。2つの軽い動きで、ウェルの各ポストの後ろにセルサスペンションを広げます。
10センチメートルの培養プレートに蓋を置き、約5分間摂氏37度の組織培養インキュベーターに移します。細胞ECM混合物が重合した後、各ミオタクティブウェルに200マイクロリットルの事前温めた組織成長培地を加えます。10センチメートル皿の蓋を交換し、分化するまでインキュベーターに保管してください。
14日間の培養期間中、筋芽細胞は、軽度の戦術でよく自己組織化することによってネイティブ組織の側面を表示し、多核の線条筋を有する3D微小組織を形成した。ミオチューブはサルコメアストリエーションを有しており、これは肉体系αアクチニンの免疫染色によって可視化された。よく整列した筋管を達成するためには、ピペット化中の気泡形成、または吸引中の多発性コーティングの損傷などの技術的な誤りを避けるべきである。
低周波および高周波電気刺激に応答して筋調性ウェルプレートポストの代表的な変位を示し、ここでは、ミオチューブが様々な電気刺激に反応し、それに応じて収縮することを示す。ポスト変位の定量化により、HMMTの絶対収縮力への変換が可能となり、GCaMP6トランスデュース型筋芽細胞から作られたHMTに対するカルシウムの半減率も低、高周波刺激に応答して分析された。
蛍光強度の定量化は、HMMTsのカルシウム処理特性の測定として使用することができる。この組織播種を初めて行うほとんどの人は、細胞外マトリックスをウェルに加え、気泡形成に苦労します。細胞で最初に試みる前に、非常に単純な粘性溶液を使用して、いくつかの予備の微小組織培養井戸で技術を実践することをお勧めします。
