Nosso protocolo descreve métodos detalhados para fabricar e analisar uma cultura microtissue muscular esquelética humana 3D. Microtissues musculares podem ser aplicados a estudos de biologia muscular básica, modelagem de doenças ou para testes de moléculas de candidatos. A principal vantagem dessa técnica é que permite a avaliação in situ da força contratil e dos transitórios de cálcio.
Por causa disso, você pode realizar estudos longitudinais da função do tecido muscular. Demonstrando o procedimento estarão Brennen Musgrave e Heta Lad, estudantes de pós-graduação do meu laboratório. Duas a três horas antes da semeadura celular, coloque uma porção de placa tática de seis bem suave em um prato de cultura celular de 10 centímetros.
Prepare bem cada cultura miotactica individual adicionando 100 microliters de uma solução F-127 plurônica de 5%. Use a tampa para cobrir os poços, e aplique um filme de parafina para selar o prato. Centrifugar o prato a 1.550 vezes G por um minuto em uma centrífuga equipada com um adaptador spinner de placa.
Armazene o prato de cultura a quatro graus Celsius até que as células estejam prontas para semeadura. Em seguida, descongele lentamente 150 alíquotas de microliter de extrato de membrana do porão, e 110 alíquotas de microliter de trombina no gelo na capa da cultura. Trabalhando na capa de cultura celular, adicione 700 microliters de solução salina de 0,9% a um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro contendo sete miligramas de fibrinogênio em pó.
Coloque o tubo em uma incubadora de cultura celular Celsius de 37 graus por três a cinco minutos sem vórtice. Remova e gire o tubo suavemente, em seguida, gire a solução dissolvida em uma micro centrífuga antes de devolvê-lo ao capô da cultura. Filtre a solução de fibrinogênio usando uma seringa de um mililitro equipada com um filtro de seringa de 0,22 micrômetros.
Em seguida, transfira a solução de fibrinogênio dissolvida para gelo ao lado do extrato de membrana do porão e alíquotas de trombina. Prepare e pré-aqueça a mídia de crescimento tecidual a 37 graus Celsius, que será introduzida nos poços de cultura após a semeadura dos tecidos. Remova as placas de cultura celular da incubadora e aspire os meios de cultura.
Em seguida, lave as células uma vez adicionando cinco mililitros de DPBS em cada placa de cultura. Aspire o DPBS e desprende as células adicionando um mililitro de 0,25% de trippsina EDTA em cada prato de cultura. Coloque a placa na incubadora de cultura celular por três minutos, segure a trippsina adicionando três mililitros de meio de lavagem ao prato de cultura, em seguida, transfira as células para um tubo cônico de tamanho apropriado.
Pelota as células por centrifugação a 400 vezes G por 10 minutos. Aspire a mídia cuidadosamente sem danificar a pelota celular, em seguida, suspenda novamente as células em um mililitro do meio de lavagem. Conte as células usando um hemótmetro e um corante azul trypan sob microscopia de campo brilhante.
Para semear seis tecidos, prepare células suficientes e matriz extracelular para oito tecidos, contabilizando assim perdas e formação de bolhas. Transfira 1,2 milhão de células para um novo tubo cônico e, em seguida, aumente o volume para 10 milímetros com meio de lavagem. Pelota as células por centrifugação a 400 vezes G por 10 minutos.
Prepare 150 microliters de mistura ECM em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro e armazene a mistura no gelo até o uso. Aspire a mídia do tubo cônico contendo as células, tomando cuidado para evitar a pelota celular. Filme vigorosamente a extremidade do tubo com um dedo enluvado até que a pelota apareça como um chorume celular.
Transfira 120 microliters da solução ECM para o tubo contendo o chorume celular, e cuidadosamente pipeta para cima e para baixo para suspender completamente as células dentro do ECM para gerar uma única suspensão celular. Evite criar bolhas e coloque a suspensão ECM da célula no gelo até usar. Coloque o prato refrigerado de 10 centímetros contendo os poços miotáticos em cima de uma bolsa de gelo dentro do capô de cultura celular, e aspire a solução plurônica F-127 de cada poço.
Permita que a solução plurônica residual F-127 seja liberada do PDMS poroso, e acomode-se no fundo do poço, deixando os poços sentarem por cinco minutos no gelo, depois aspirar novamente. Pipete a célula suspensão ECM cuidadosamente para re-suspender as células, em seguida, transferir 105 microliters da suspensão para um tubo fresco, pré-refrigerado 1.5 mililitro, agarrando-o perto do topo. Adicione 0,84 microliters de 100 unidades por solução de estoque de trombina mililitro aos 105 microliters da suspensão ECM celular.
Pipeta rapidamente e completamente para misturar, evitando a introdução de bolhas. Adicione 15 microliters da mistura ECM da célula a cada poço sem pressionar a pipeta na parte inferior do poço. Com dois movimentos leves, espalhe a suspensão da célula atrás de cada poste no poço.
Coloque a tampa na placa de cultura de 10 centímetros e transfira-a para uma incubadora de cultura de tecido de 37 graus Celsius por aproximadamente cinco minutos. Adicione 200 microliters de mídia de crescimento de tecido pré-aquecido a cada poço miotactico depois que a mistura de ECM celular tiver polimerizado. Substitua a tampa do prato de 10 centímetros e mantenha-a na incubadora até a diferenciação.
Durante um período de cultura de 14 dias, os myoblasts mostraram os aspectos do tecido nativo auto-organizando-se na tática suave bem para formar um microtissue 3D com miótubos estriados multinucleados. Myotubes têm estrias de sarcomere, que foram visualizadas por imunostendante para actinina alfa sarcomeric. Para alcançar miotubes bem alinhados, erros técnicos como a formação de bolhas durante a pipetação ou o revestimento plurônico prejudicial durante a aspiração devem ser evitados.
Um deslocamento representativo do poste de placa de poço miotático em resposta à estimulação elétrica de baixa e alta frequência, é mostrado aqui, indicando que os mofátuos respondem a diferentes estímulos elétricos e contraem em conformidade. A quantificação do deslocamento pós-deslocamento permite a conversão à força contratil absoluta dos HMMTs. Transitoriedade de cálcio em HMMTs feitas a partir de míbios transduzidos por GCaMP6 também foram analisados em resposta à estimulação de baixa e alta frequência.
A quantificação da intensidade fluorescente pode ser usada como medida para as propriedades de manuseio de cálcio dos HMMTs. A maioria das pessoas que realizam essa semeadura tecidual pela primeira vez, lutam para adicionar a matriz extracelular celular aos poços, e com a formação de bolhas. Recomendamos praticar a técnica em alguns poços de cultura microtissue sobressalentes com uma solução viscosa muito simples antes da primeira tentativa com células.
