우리의 프로토콜은 3D 인간 골격 근육 미세 조직 배양을 제조하고 분석하는 상세한 방법을 설명합니다. 근육 미세 조직은 기본적인 근육 생물학의 연구, 질병 모델링, 또는 후보 분자 테스트에 적용 될 수있다. 이 기술의 주요 장점은 수축력과 칼슘 과도의 시차 평가를 허용한다는 것입니다.
이 때문에 근육 조직 기능에 대한 종방향 연구를 수행 할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 브레넨 머스그레이브와 헤타 라드가 될 것입니다. 세포 파종 2~3시간 전에 6개의 잘 온화한 전술 플레이트 부분을 10센티미터 세포 배양 접시에 넣습니다.
5%의 피루론 F-127 용액의 100마이크로리터를 추가하여 각 개별 근문 문화를 잘 준비한다. 뚜껑을 사용하여 우물을 덮고 파라핀 필름을 바르면 접시를 밀봉합니다. 접시 스피너 어댑터가 장착된 원심분리기에서 1, 550회 G로 접시를 원심분리합니다.
세포가 파종 할 준비가 될 때까지 배양 접시를 섭씨 4도에 보관하십시오. 그런 다음 지하 멤브레인 추출물의 150 마이크로리터 알리쿼트와 문화 후드의 얼음에 혈소판 알리쿼트 110을 천천히 해동합니다. 세포 배양 후드에서 작업, 추가 700 0.9% 식염수 용액의 마이크로 리터 1.5 분말 피브리노겐의 7 밀리 그램을 포함 하는 1.5 밀리 리터 마이크로 원심 분리 기 튜브.
튜브를 섭씨 37도 세포 배양 인큐베이터에 3~5분간 영양없이 놓습니다. 튜브를 부드럽게 제거하고 플릭한 다음 펄스는 용존 솔루션을 마이크로 원심분리기로 스핀한 다음 배양 후드로 되돌게 됩니다. 0.22 마이크로미터 주사기 필터가 장착된 1밀리리터 주사기를 사용하여 피브리노젠 용액을 필터링합니다.
그런 다음 용존 피브리노겐 용액을 지하 막 추출물 및 트롬빈 알리쿼트와 함께 얼음으로 옮기습니다. 조직 을 시드 한 후 문화 우물에 소개 될 37 섭씨에서 조직 성장 미디어를 준비하고 미리 따뜻하게하십시오. 인큐베이터에서 세포 배양 판을 제거하고 배양 매체를 흡인한다.
그런 다음 각 배양 판에 DPBS의 5 밀리리터를 추가하여 세포를 한 번 씻으시다. DPBS를 흡인하고 각 배양 접시에 0.25%의 트립신 EDTA1밀리리터를 추가하여 세포를 분리합니다. 3 분 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓고 배양 접시에 세척 매체의 3 밀리리터를 추가하여 트립신을 잡고 적절한 크기의 원추형 튜브로 세포를 옮김시합니다.
10 분 동안 400 회 G에서 원심 분리하여 세포를 펠렛. 세포 펠릿을 손상시키지 않고 조심스럽게 미디어를 흡인한 다음 세척 매체의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 밝은 필드 현미경 검사의 밑에 혈우세포계 및 trypan 파란 염료를 사용하여 세포를 계산합니다.
6개의 조직을 종자하기 위하여는, 8개의 조직을 위한 충분한 세포 및 세포외 매트릭스를 준비하여, 따라서 손실 및 거품 형성을 고려합니다. 120만 개의 세포를 새로운 원물 튜브로 옮은 다음 세척 매체로 부피를 10mm로 늘립니다. 10 분 동안 400 회 G에서 원심 분리하여 세포를 펠렛.
1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 150 마이크로리터의 ECM 혼합물을 준비하고, 사용전까지 혼합물을 얼음에 보관합니다. 세포를 포함하는 원적 관에서 미디어를 흡인하고, 세포 펠릿을 피하기 위해 주의를 기울입니다. 펠릿이 세포 슬러리로 나타날 때까지 장갑을 낀 손가락으로 튜브 끝을 힘차게 쓸어 넘깁니다.
ECM 용액120마이크로리터를 세포 슬러리를 함유하는 튜브로 옮기고, ECM 내의 세포를 완전히 다시 일시 중단하여 단일 세포 현탁액을 생성한다. 거품을 만들지 말고 셀 ECM 서스펜션을 사용할 때까지 얼음위에 놓습니다. 세포 배양 후드 내부에 얼음 팩 위에 근사 우물이 들어 있는 냉장 10센티미터 접시를 놓고 각 우물에서 플라우론 F-127 용액을 흡인시합니다.
잔류 물루F-127 용액이 다공성 PDMS에서 방출하고 우물이 얼음위에 5분 동안 앉게 한 다음 다시 흡입하여 우물 바닥에 정착할 수 있습니다. 세포 ECM 현탁액을 조심스럽게 피펫하여 세포를 다시 중단한 다음, 서스펜션의 105 마이크로리터를 상한 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 상단에 가깝게 잡습니다. 셀 ECM 서스펜션의 105 마이크로리터에 밀리리터 트롬빈 스톡 솔루션당 100단위의 0.84 마이크로리터를 추가합니다.
피펫은 거품의 도입을 피하고, 혼합하기 위해 신속하고 철저하게 혼합합니다. 파이펫을 우물 바닥에 누르지 않고 각 웰에 셀 ECM 혼합물의 15 마이크로리터를 추가합니다. 두 개의 가벼운 움직임으로, 우물의 각 포스트 뒤에 셀 서스펜션을 확산.
뚜껑을 10센티미터 배양판에 놓고 섭씨 37도 조직 배양 배양인으로 약 5분간 옮김합니다. 전세포 ECM 혼합물이 중합된 후 각 근사에 미리 따뜻해지는 조직 성장 매체200 마이크로리터를 첨가한다. 10센티미터 접시의 뚜껑을 교체하고 분화될 때까지 인큐베이터에 보관하십시오.
14일 배양 기간 동안, myoblasts는 다중 핵염기 심포투를 가진 3D 마이크로 조직을 형성하기 위하여 온화한 전술에서 잘 조직함으로써 토착 조직의 양상을 표시했습니다. Myotubes는 육종 알파 액틴에 대한 면역 스테인링에 의해 시각화 된 사코메르 규형이 있습니다. 잘 정렬된 근관을 달성하기 위해, 피펫팅 하는 동안 거품 형성, 또는 포부 동안 손상 pluronic 코팅 과 같은 기술적 인 오류를 피해야한다.
저파 및 고주파 전기 자극에 대응하여 근기성 음판소의 대표적인 변위가 여기에 표시되어, 심투우가 다양한 전기 자극에 반응하고 그에 따라 수축된다는 것을 나타낸다. 포스트 변위의 정량화는 HMMT의 절대 수축력으로 변환할 수 있게 합니다. GCaMP6-트랜스포제드 근막세포로 만든 HMMT에 대한 칼슘 트랜지션도 저주파 자극에 대한 응답으로 분석되었다.
형광 강도의 정량화는 HMMT의 칼슘 취급 특성에 대한 측정으로 사용될 수 있다. 처음으로이 조직 시드를 수행하는 대부분의 사람들은 우물에 세포 외 세포 매트릭스를 추가하고 거품 형성으로 어려움을 겪습니다. 우리는 세포와 첫 번째 시도 하기 전에 매우 간단한 점성 솔루션일부 예비 미세 조직 배양 우물에 기술을 연습 하는 것이 좋습니다.
