Nuestro protocolo describe métodos detallados para fabricar y analizar un cultivo de microtis del músculo esquelético humano en 3D. Los microtejidos musculares se pueden aplicar a estudios de biología muscular básica, modelado de enfermedades o para pruebas de moléculas candidatas. La principal ventaja de esta técnica es que permite la evaluación in situ de la fuerza contráctil y los transitorios de calcio.
Debido a esto, puede realizar estudios longitudinales de la función del tejido muscular. Demostrando el procedimiento estarán Brennen Musgrave y Heta Lad, estudiantes graduados de mi laboratorio. Dos o tres horas antes de la siembra celular, coloque una porción de placa táctica suave de seis pozos en una placa de cultivo celular de 10 centímetros.
Prepare bien cada cultivo miotáctico individual agregando 100 microlitros de una solución F-127 5% plurónica. Use la tapa para cubrir los pozos y aplique una película de parafina para sellar el plato. Centrifugar el plato a 1, 550 veces G durante un minuto en una centrífuga equipada con un adaptador de plato giratorio.
Guarde el plato de cultivo a cuatro grados centígrados hasta que las células estén listas para la siembra. Luego descongele lentamente 150 alícuotas de microlitros de extracto de membrana basal y 110 alícuotas de microlitros de trombina en hielo en la campana de cultivo. Trabajando en la campana de cultivo celular, agregue 700 microlitros de solución salina al 0.9% a un tubo de micro centrífuga de 1.5 mililitros que contiene siete miligramos de fibrinógeno en polvo.
Coloque el tubo en una incubadora de cultivo celular de 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos sin vórtice. Retire y mueva el tubo suavemente, luego haga girar por pulso la solución disuelta en una micro centrífuga antes de devolverla a la campana de cultivo. Filtre la solución de fibrinógeno con una jeringa de un mililitro equipada con un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros.
Luego transfiera la solución de fibrinógeno disuelto al hielo junto con el extracto de la membrana basal y las alícuotas de trombina. Prepare y precaliente los medios de crecimiento del tejido a 37 grados centígrados, que se introducirán en los pozos de cultivo después de sembrar los tejidos. Retire las placas de cultivo celular de la incubadora y aspire los medios de cultivo.
Luego lave las células una vez agregando cinco mililitros de DPBS en cada placa de cultivo. Aspire el DPBS y separe las células agregando un mililitro de EDTA de tripsina al 0,25% en cada plato de cultivo. Coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante tres minutos, sostenga la tripsina agregando tres mililitros de medio de lavado a la placa de cultivo, luego transfiera las células a un tubo cónico del tamaño adecuado.
Peletizar las células centrifugando a 400 veces G durante 10 minutos. Aspire el medio con cuidado sin dañar la bolita celular, luego vuelva a suspender las células en un mililitro del medio de lavado. Cuente las células usando un hemocitómetro y un tinte azul tripano bajo microscopía de campo brillante.
Para sembrar seis tejidos, prepare suficientes células y matriz extracelular para ocho tejidos, lo que representa las pérdidas y la formación de burbujas. Transfiera 1,2 millones de células a un nuevo tubo cónico, luego aumente el volumen a 10 milímetros con el medio de lavado. Peletizar las células centrifugando a 400 veces G durante 10 minutos.
Prepare 150 microlitros de mezcla de ECM en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros y guarde la mezcla en hielo hasta su uso. Aspire los medios del tubo cónico que contiene las células, teniendo cuidado de evitar el pellet celular. Mueva vigorosamente el extremo del tubo con un dedo enguantado hasta que el gránulo aparezca como una suspensión celular.
Transfiera 120 microlitros de la solución de ECM al tubo que contiene la suspensión celular, y pipetee cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender completamente las células dentro de la ECM para generar una suspensión de una sola celda. Evite crear burbujas, luego coloque la suspensión de ECM de la celda sobre hielo hasta su uso. Coloque el plato refrigerado de 10 centímetros que contiene los pocillos miotácticos sobre una bolsa de hielo dentro de la campana de cultivo celular, y aspire la solución plurónica F-127 de cada pozo.
Permita que la solución plurónica residual F-127 se libere del PDMS poroso y se asiente en el fondo del pozo dejando que los pozos se asienten durante cinco minutos en hielo, luego aspire nuevamente. Pipetee la suspensión ECM de la celda con cuidado para volver a suspender las células, luego transfiera 105 microlitros de la suspensión a un tubo fresco de 1,5 mililitros preenfriado agarrándolo cerca de la parte superior. Agregue 0,84 microlitros de 100 unidades por mililitro de solución madre de trombina a los 105 microlitros de suspensión de ECM celular.
Pipetear rápida y completamente para mezclar, evitando la introducción de burbujas. Agregue 15 microlitros de la mezcla de ECM celular a cada pozo sin presionar la pipeta en el fondo del pozo. Con dos movimientos ligeros, extienda la suspensión celular detrás de cada poste en el pozo.
Coloque la tapa en la placa de cultivo de 10 centímetros y transfiérala a una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius durante aproximadamente cinco minutos. Agregue 200 microlitros de medios de crecimiento de tejido precalentados a cada pozo miotáctico después de que la mezcla de ECM celular se haya polimerizado. Reemplace la tapa en el plato de 10 centímetros y manténgalo en la incubadora hasta la diferenciación.
Durante un período de cultivo de 14 días, los mioblastos mostraron los aspectos del tejido nativo autoorganizándose en el pozo táctico suave para formar un microtejido 3D con miotubos estriados multinucleados. Los miotubos tienen estrías de sarcómeros, que se visualizaron mediante inmunotinción para la alfa actinina sarcomérica. Para lograr miotubos bien alineados, se deben evitar errores técnicos como la formación de burbujas durante el pipeteo o el recubrimiento plurónico dañino durante la aspiración.
Aquí se muestra un desplazamiento representativo del poste de la placa del pozo miotáctico en respuesta a la estimulación eléctrica de baja y alta frecuencia, lo que indica que los miotubos responden a estímulos eléctricos variables y se contraen en consecuencia. La cuantificación del desplazamiento posterior permite la conversión a fuerza contráctil absoluta de los HMMT. También se analizó la transitoriedad de calcio en hmmT hecha de mioblastos transducidos por GCaMP6 en respuesta a la estimulación de baja y alta frecuencia.
La cuantificación de la intensidad fluorescente se puede utilizar como medida de las propiedades de manejo de calcio de los HMMT. La mayoría de las personas que realizan esta siembra de tejido por primera vez, luchan con la adición de la matriz extracelular celular a los pozos y con la formación de burbujas. Recomendamos practicar la técnica en algunos pozos de cultivo de microtejidos de repuesto con una solución viscosa muy simple antes del primer intento con células.
