Notre protocole décrit des méthodes détaillées pour fabriquer et analyser une culture de microtissu de muscle squelettique humain en 3D. Les microtissus musculaires peuvent être appliqués à des études de biologie musculaire de base, à la modélisation de maladies ou à des tests de molécules candidates. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’évaluer in situ la force contractile et les transitoires calciques.
Pour cette raison, vous pouvez mener des études longitudinales de la fonction du tissu musculaire. Brennen Musgrave et Heta Lad, des étudiants diplômés de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Deux à trois heures avant l’ensemencement cellulaire, placez une portion de six plaques tactiques bien douces dans un plat de culture cellulaire de 10 centimètres.
Préparez bien chaque culture myotactique individuelle en ajoutant 100 microlitres d’une solution de F-127 pluronique à 5%. Utilisez le couvercle pour couvrir les puits et appliquez un film de paraffine pour sceller le plat. Centrifugez la boîte à 1 550 fois G pendant une minute dans une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de spinner à plaque.
Conservez la boîte de culture à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules soient prêtes pour l’ensemencement. Ensuite, décongelez lentement 150 microlitres aliquotes d’extrait de membrane basale et 110 microlitres aliquotes de thrombine sur la glace dans la hotte de culture. En travaillant dans la hotte de culture cellulaire, ajoutez 700 microlitres de solution saline à 0,9% à un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant sept milligrammes de fibrinogène en poudre.
Placez le tube dans un incubateur de culture cellulaire de 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes sans vortex. Retirez et faites glisser doucement le tube, puis faites tourner la solution dissoute dans une microcentrifugation avant de la renvoyer dans la hotte de culture. Filtrer la solution de fibrinogène à l’aide d’une seringue d’un millilitre équipée d’un filtre à seringue de 0,22 micromètre.
Ensuite, transférez la solution de fibrinogène dissoute dans la glace à côté de l’extrait de membrane basale et des aliquotes de thrombine. Préparez et préchauffez le milieu de croissance tissulaire à 37 degrés Celsius, qui sera introduit dans les puits de culture après l’ensemencement des tissus. Retirez les plaques de culture cellulaire de l’incubateur et aspirez le milieu de culture.
Ensuite, lavez les cellules une fois en ajoutant cinq millilitres de DPBS dans chaque plaque de culture. Aspirer le DPBS et détacher les cellules en ajoutant un millilitre de 0,25% de trypsine EDTA dans chaque boîte de culture. Placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois minutes, maintenez la trypsine en ajoutant trois millilitres de milieu de lavage à la boîte de culture, puis transférez les cellules dans un tube conique de taille appropriée.
Abattez les cellules en les centrifugant à 400 fois G pendant 10 minutes. Aspirer soigneusement le milieu sans endommager la pastille cellulaire, puis suspendre à nouveau les cellules dans un millilitre du milieu de lavage. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’un colorant bleu trypan sous microscopie à champ lumineux.
Pour ensemencer six tissus, préparez suffisamment de cellules et de matrice extracellulaire pour huit tissus, tenant ainsi compte des pertes et de la formation de bulles. Transférez 1,2 million de cellules dans un nouveau tube conique, puis augmentez le volume à 10 millimètres avec un milieu de lavage. Abattez les cellules en les centrifugant à 400 fois G pendant 10 minutes.
Préparer 150 microlitres de mélange ECM dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et stocker le mélange sur de la glace jusqu’à utilisation. Aspirer le milieu du tube conique contenant les cellules, en prenant soin d’éviter la pastille cellulaire. Agitez vigoureusement l’extrémité du tube avec un doigt ganté jusqu’à ce que la pastille apparaisse comme une boue cellulaire.
Transférer 120 microlitres de la solution ECM dans le tube contenant la boue cellulaire et pipeter soigneusement de haut en bas pour suspendre complètement les cellules dans l’ECM afin de générer une suspension à cellule unique. Évitez de créer des bulles, puis placez la suspension ECM cellulaire sur de la glace jusqu’à l’utilisation. Placez le plat réfrigéré de 10 centimètres contenant les puits myotactiques sur un sac de glace à l’intérieur de la hotte de culture cellulaire et aspirez la solution pluronique de F-127 de chaque puits.
Laissez la solution pluronique résiduelle de F-127 se libérer du PDMS poreux et déposez-la au fond du puits en laissant les puits reposer pendant cinq minutes sur la glace, puis aspirer à nouveau. Pipettez soigneusement la suspension ECM de la cellule pour les remettre en suspension, puis transférez 105 microlitres de la suspension dans un tube frais et pré-réfrigéré de 1,5 millilitre en le saisissant près du sommet. Ajouter 0,84 microlitre de 100 unités par millilitre de solution mère de thrombine aux 105 microlitres de suspension ECM cellulaire.
Pipette rapide et complète pour mélanger, en évitant l’introduction de bulles. Ajouter 15 microlitres du mélange ECM cellulaire à chaque puits sans presser la pipette dans le fond du puits. Avec deux mouvements légers, étalez la suspension cellulaire derrière chaque poteau du puits.
Placez le couvercle sur la plaque de culture de 10 centimètres et transférez-le dans un incubateur de culture tissulaire de 37 degrés Celsius pendant environ cinq minutes. Ajouter 200 microlitres de milieux de croissance tissulaire préchauffés à chaque puits myotactique après la polymérisation du mélange ECM cellulaire. Remplacez le couvercle du plat de 10 centimètres et conservez-le dans l’incubateur jusqu’à la différenciation.
Au cours d’une période de culture de 14 jours, les myoblastes ont montré les aspects du tissu natif en s’auto-organisant dans le puits de tactique douce pour former un microtissu 3D avec des myotubes striés multi-nucléés. Les myotubes ont des stries de sarcomères, qui ont été visualisées par immunocoloration pour l’alpha-actinine sarcomérique. Pour obtenir des myotubes bien alignés, les erreurs techniques telles que la formation de bulles lors du pipetage ou l’endommagement du revêtement pluronique lors de l’aspiration doivent être évitées.
Un déplacement représentatif du poteau de la plaque de puits myotactique en réponse à une stimulation électrique à basse et haute fréquence est montré ici, indiquant que les myotubes répondent à des stimuli électriques variables et se contractent en conséquence. La quantification du post-déplacement permet la conversion en force contractile absolue des HMMT. L’éphémère en calcium sur les HMMT fabriqués à partir de myoblastes transduis par GCaMP6 a également été analysé en réponse à une stimulation à basse et haute fréquence.
La quantification de l’intensité fluorescente peut être utilisée comme mesure des propriétés de manipulation du calcium des HMMT. La plupart des personnes qui effectuent cet ensemencement tissulaire pour la première fois ont du mal à ajouter la matrice extracellulaire cellulaire aux puits et à former des bulles. Nous recommandons de pratiquer la technique sur certains puits de culture de microtissu de rechange avec une solution visqueuse très simple avant la première tentative avec des cellules.
