Protokolümüz, 3D insan iskelet kası mikrotissue kültürünün imal ve analizini yapmak için ayrıntılı yöntemleri açıklar. Kas mikrotizeleri temel kas biyolojisi, hastalık modellemesi veya aday molekül testi çalışmalarına uygulanabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kontrtil kuvvet ve kalsiyum geçicilerinin yerinde değerlendirilmesine izin ver olmasıdır.
Bu nedenle, kas dokusu fonksiyonunun boyuna çalışmalarını yapabilirsiniz. Prosedürü gösteren brennen Musgrave ve Heta Lad olacak, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencileri. Hücre tohumlamadan iki ila üç saat önce, 10 santimetrelik bir hücre kültürü kabına altı iyi hafif taktik plaka kısmı yerleştirin.
%5 pluronik F-127 çözümünün 100 mikrolitresi ekleyerek her bir miyotik kültürü iyi hazırlayın. Kuyuları kapatmak için kapağı kullanın ve kabı kapatmak için bir parafin filmi uygulayın. Tabağı, bir plaka spinner adaptörü ile donatılmış bir santrifüjde bir dakika boyunca 1.550 kez G'de santrifüjlayın.
Hücreler tohumlama için hazır olana kadar kültür çanasını dört santigrat derecede saklayın. Sonra yavaşça bodrum membran özü 150 mikrolitre aliquot ve kültür kaput buz üzerinde trombin 110 mikrolitre aliquot çözün. Hücre kültürü davlumbazında çalışarak, yedi miligram toz fibrinojen içeren 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne% 0,9 salin çözeltisinin 700 mikrolitresini ekleyin.
Tüpü 37 santigrat derece hücre kültürü inkübatörüne girdapsız üç ila beş dakika yerleştirin. Tüpü yavaşça çıkarın ve hareket ettirin, ardından çözünmüş çözeltiyi kültür başlığına geri vermeden önce bir mikro santrifüjde nabız döndürün. Fibrinojen çözeltisini 0,22 mikrometre şırınga filtresi ile donatılmış bir mililitre şırınga kullanarak filtreleyin.
Daha sonra çözünmüş fibrinojen çözeltisini bodrum membran özü ve trombin aliquots ile birlikte buza aktarın. Dokuların tohumlandıktan sonra kültür kuyularına tanıtılacak olan 37 santigrat derecede doku büyüme ortamını hazırlayın ve önceden ısıtın. Hücre kültürü plakalarını inkübatörden çıkarın ve kültür medyasını aspire edin.
Daha sonra her kültür plakasına beş mililitre DPBS ekleyerek hücreleri bir kez yıkayın. DPBS'yi epire edin ve her kültür yemeğine bir mililitre %0,25 trypsin EDTA ekleyerek hücreleri ayırın. Plakayı üç dakika boyunca hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin, kültür kabına üç mililitre yıkama ortamı ekleyerek tripsin tutun, ardından hücreleri uygun boyutta bir konik tüpe aktarın.
Hücreleri 10 dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyarak peletleyin. Hücre peletine zarar vermeden medyayı dikkatlice emiş, ardından hücreleri yıkama ortamının bir mililitresinde yeniden askıya alın. Parlak alan mikroskopisi altında hemositometre ve trypan mavi boya kullanarak hücreleri sayın.
Altı dokuyu tohumlamak için, sekiz doku için yeterli hücre ve hücre dışı matris hazırlayın, böylece kayıplar ve kabarcık oluşumu için muhasebe. 1,2 milyon hücreyi yeni bir konik tüpe aktarın, ardından yıkama ortamıyla hacmi 10 milimetreye çıkarın. Hücreleri 10 dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyarak peletleyin.
1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpünde 150 mikrolitre ECM karışımı hazırlayın ve karışımı kullanıma kadar buz üzerinde saklayın. Hücre peletinden kaçınmaya dikkat ederek, hücreleri içeren konik tüpten ortamı epire edin. Pelet bir hücre bulamacı olarak görünene kadar tüpün ucunun ucunun eldivenli bir parmakla kuvvetlice hareket ettirdiği kesin.
ECM çözeltisinin 120 mikrolitresini hücre bulamacı içeren tüpe aktarın ve tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için ECM içindeki hücreleri tamamen yeniden askıya almak için dikkatlice yukarı ve aşağı pipet. Kabarcıklar oluşturmaktan kaçının, ardından hücre ECM süspansiyonunu kullanıma kadar buza yerleştirin. Miyotaktik kuyuları içeren so soğutmalı 10 santimetrelik tabağı hücre kültürü kaputunun içindeki bir buz torbasının üzerine yerleştirin ve pluronik F-127 çözeltisini her kuyudan epire edin.
Artık pluronik F-127 çözeltisinin gözenekli PDMS'den salınmasına izin verin ve kuyuların buz üzerinde beş dakika bekletilmesine izin vererek kuyunun dibine yerleşin, sonra tekrar aspire edin. Hücreleri yeniden askıya almak için hücre ECM süspansiyonuna dikkatlice pipetlayın, ardından süspansiyonun 105 mikrolitresini, üste yakın kavrayarak taze, önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. 105 mikrolitre hücre ECM süspansiyonu için mililitre trombin stok çözeltisi başına 100 birimlik 0,84 mikrolitre ekleyin.
Pipet hızlı ve iyice karıştırmak için, kabarcıkların girişinden kaçınarak. Pipet kapağını kuyunun dibine bastırmadan her kuyuya 15 mikrolitre hücre ECM karışımı ekleyin. İki hafif hareketle, hücre süspansiyonu kuyudaki her direğin arkasına yayın.
Kapağı 10 santimetrelik kültür plakasına yerleştirin ve yaklaşık beş dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir doku kültürü inkübatörüne aktarın. Hücre ECM karışımı polimerize olduktan sonra her miyoaktik kuyuya 200 mikrolitre önceden ısıtılmış doku büyüme ortamı ekleyin. 10 santimetrelik kabın kapağını değiştirin ve farklılaşmaya kadar inkübatörde tutun.
14 günlük bir kültür döneminde, mioblastlar, çok çekirdekli çizgili miyotütler ile 3D mikrotissue oluşturmak için hafif taktik kuyusunda kendi kendini düzenleyerek yerel dokunun yönlerini sergiledi. Miyotubes sarkoer alfa aktinin için immünostaining ile görselleştirilmiş sarkom çizgilerine sahiptir. İyi hizalanmış miyotütler elde etmek için pipetleme sırasında kabarcık oluşumu veya aspirasyon sırasında pluronik kaplamaya zarar verme gibi teknik hatalardan kaçınılmalıdır.
Miyotoptik kuyu plakası direğinin düşük ve yüksek frekanslı elektriksel stimülasyona yanıt olarak temsili bir yer değiştirmesi, miyotütlerin değişen elektrik uyaranlarına yanıt verdiğini ve buna göre büzülmeye cevap verdiğini gösterir. Post yer değiştirmenin nicelleştirilmesi, HMMT'lerin mutlak kontuplasyon kuvvetine dönüştürülmesine izin verir.
Floresan yoğunluğunun nicelemesi, HMMT'lerin kalsiyum işleme özellikleri için ölçüm olarak kullanılabilir. Bu doku tohumlamasını ilk kez yapan çoğu insan, hücre dışı matrisi kuyulara eklemek ve kabarcık oluşumu ile mücadele eder. Hücrelerle ilk denemeden önce çok basit bir viskoz çözelti ile bazı yedek mikrotissue kültür kuyularında tekniği uygulamanızı öneririz.
