Unser Protokoll beschreibt detaillierte Methoden zur Herstellung und Analyse einer 3D-Mikrogewebekultur des menschlichen Skelettmuskels. Muskelmikrogewebe können für Studien der grundlegenden Muskelbiologie, Krankheitsmodellierung oder für Kandidatenmolekültests angewendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine In-situ-Beurteilung der kontraktilen Kraft und der Calciumtransienten ermöglicht.
Aus diesem Grund können Sie Längsschnittuntersuchungen der Muskelgewebefunktion durchführen. Brennen Musgrave und Heta Lad, Doktoranden aus meinem Labor, werden das Verfahren demonstrieren. Legen Sie zwei bis drei Stunden vor der Zellaussaat eine sechs gut milde taktische Tellerportion in eine 10 Zentimeter große Zellkulturschale.
Bereiten Sie jede einzelne myotaktische Kultur gut vor, indem Sie 100 Mikroliter einer 5% pluronischen F-127-Lösung hinzufügen. Verwenden Sie den Deckel, um die Vertiefungen abzudecken, und tragen Sie einen Paraffinfilm auf, um die Schüssel zu versiegeln. Zentrifugieren Sie die Schale bei 1.550 mal G für eine Minute in einer Zentrifuge, die mit einem Plattenspinneradapter ausgestattet ist.
Lagern Sie die Kulturschale bei vier Grad Celsius, bis die Zellen für die Aussaat bereit sind. Dann langsam 150 Mikroliter Aliquot Basalmembranextrakt und 110 Mikroliter Aliquot Thrombin auf Eis in der Kulturhaube auftauen. In der Zellkulturhaube werden 700 Mikroliter 0,9% Kochsalzlösung zu einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen mit sieben Milligramm pulverisiertem Fibrinogen gegeben.
Legen Sie das Röhrchen für drei bis fünf Minuten ohne Wirbelung in einen 37 Grad Celsius großen Zellkultur-Inkubator. Entfernen und streichen Sie das Röhrchen vorsichtig, dann pulsieren Sie die gelöste Lösung in einer Mikrozentrifuge, bevor Sie sie in die Kulturhaube zurückführen. Filtrieren Sie die Fibrinogenlösung mit einer Ein-Milliliter-Spritze, die mit einem 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter ausgestattet ist.
Dann die gelöste Fibrinogenlösung zusammen mit dem Basalmembranextrakt und den Thrombin-Aliquots auf Eis übertragen. Bereiten Sie die Gewebewachstumsmedien bei 37 Grad Celsius vor und erwärmen Sie sie vor, die nach der Aussaat der Gewebe in die Kulturtöpfe eingebracht werden. Entfernen Sie die Zellkulturplatten aus dem Inkubator und aspirieren Sie die Kulturmedien.
Dann waschen Sie die Zellen einmal, indem Sie fünf Milliliter DPBS in jede Kulturplatte geben. Aspirieren Sie den DPBS und lösen Sie die Zellen, indem Sie einen Milliliter 0,25% Trypsin EDTA in jede Kulturschale geben. Legen Sie die Platte für drei Minuten in den Zellkultur-Inkubator, halten Sie das Trypsin, indem Sie drei Milliliter Waschmedium in die Kulturschale geben, und übertragen Sie die Zellen dann in ein konisches Röhrchen von geeigneter Größe.
Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 400 mal G für 10 Minuten. Aspirieren Sie das Medium vorsichtig, ohne das Zellpellet zu beschädigen, und suspendieren Sie die Zellen dann in einem Milliliter des Waschmediums erneut. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblaufarbstoff unter Hellfeldmikroskopie.
Um sechs Gewebe zu säen, bereiten Sie genügend Zellen und extrazelluläre Matrix für acht Gewebe vor, wodurch Verluste und Blasenbildung berücksichtigt werden. Übertragen Sie 1,2 Millionen Zellen in ein neues konisches Rohr und erhöhen Sie dann das Volumen mit Waschmedium auf 10 Millimeter. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 400 mal G für 10 Minuten.
Bereiten Sie 150 Mikroliter ECM-Mischung in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor und lagern Sie die Mischung bis zur Verwendung auf Eis. Aspirieren Sie das Medium aus dem konischen Röhrchen, das die Zellen enthält, und achten Sie darauf, das Zellpellet zu vermeiden. Streichen Sie kräftig mit einem behandschuhten Finger über das Ende der Röhre, bis das Pellet als Zellschlamm erscheint.
Übertragen Sie 120 Mikroliter der ECM-Lösung auf das Röhrchen, das die Zellschlämme enthält, und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen innerhalb des ECM vollständig neu zu suspendieren, um eine einzelne Zellsuspension zu erzeugen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen und legen Sie die EcM-Suspension der Zelle bis zur Verwendung auf Eis. Legen Sie die gekühlte 10-Zentimeter-Schale mit den myotaktischen Vertiefungen auf einen Eisbeutel in der Zellkulturhaube und saugen Sie die pluronische F-127-Lösung aus jeder Vertiefung ab.
Lassen Sie die verbleibende pluronische F-127-Lösung aus dem porösen PDMS austreten und setzen Sie sich auf dem Boden des Bohrlochs ab, indem Sie die Vertiefungen fünf Minuten lang auf Eis sitzen lassen und dann erneut absaugen. Pipettieren Sie die EcM-Zellsuspension vorsichtig, um die Zellen wieder zu suspendieren, und übertragen Sie dann 105 Mikroliter der Suspension in ein frisches, vorgekühltes 1,5-Milliliter-Röhrchen, indem Sie es nahe an der Oberseite greifen. Fügen Sie 0,84 Mikroliter à 100 Einheiten pro Milliliter Thrombin-Stammlösung zu den 105 Mikrolitern Zell-ECM-Suspension hinzu.
Pipettieren Sie schnell und gründlich, um zu mischen, und vermeiden Sie die Einführung von Blasen. Fügen Sie 15 Mikroliter der Zell-ECM-Mischung zu jeder Vertiefung hinzu, ohne die Pipette in den Boden der Vertiefung zu drücken. Verteilen Sie mit zwei leichten Bewegungen die Zellsuspension hinter jedem Pfosten im Brunnen.
Legen Sie den Deckel auf die 10 Zentimeter große Kulturplatte und geben Sie ihn für etwa fünf Minuten in einen 37 Grad Celsius großen Gewebekultur-Inkubator. Fügen Sie 200 Mikroliter vorgewärmtes Gewebewachstumsmedium zu jedem myotaktischen Brunnen hinzu, nachdem die Zell-ECM-Mischung polymerisiert wurde. Ersetzen Sie den Deckel der 10-Zentimeter-Schale und bewahren Sie ihn bis zur Differenzierung im Inkubator auf.
Während einer 14-tägigen Kulturperiode zeigten Myoblasten die Aspekte des nativen Gewebes, indem sie sich in der milden Taktik gut selbst organisierten, um ein 3D-Mikrogewebe mit mehrkernigen gestreiften Myotuben zu bilden. Myotuben haben Sarkomerstreifen, die durch Immunfärbung für sarkomerisches Alpha-Actinin visualisiert wurden. Um gut ausgerichtete Myotuben zu erreichen, sollten technische Fehler wie Blasenbildung beim Pipettieren oder schädliche pluronische Beschichtungen während der Aspiration vermieden werden.
Eine repräsentative Verschiebung des myotaktischen Wellplattenpfostens als Reaktion auf nieder- und hochfrequente elektrische Stimulation ist hier gezeigt, was darauf hindeutet, dass Myotuben auf unterschiedliche elektrische Reize reagieren und sich entsprechend zusammenziehen. Die Quantifizierung der Postverschiebung ermöglicht die Umwandlung der HMMTs in absolute kontraktile Kraft. Calciumtransienz auf HMMTs aus GCaMP6-transduzierten Myoblasten wurden ebenfalls als Reaktion auf nieder- und hochfrequente Stimulation analysiert.
Die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität kann als Messung der Calcium-Handling-Eigenschaften von HMMTs verwendet werden. Die meisten Menschen, die diese Gewebeaussaat zum ersten Mal durchführen, kämpfen mit der Zugabe der extrazellulären Zellmatrix zu den Vertiefungen und mit der Bildung von Blasen. Wir empfehlen, die Technik vor dem ersten Versuch mit Zellen an einigen Ersatz-Mikrogewebekulturtöpfen mit einer sehr einfachen viskosen Lösung zu üben.
