在3D甲基纤维素基水凝胶中培养巨核细胞，以改善细胞成熟并研究僵硬和禁闭的影响

该协议允许体外评估天然巨核细胞在骨髓中暴露于的禁闭和中等硬度对其行为和成熟的影响。该技术的主要优点是简化的模型，消除了细胞 - 细胞和细胞基质相互作用，并专注于机械方面。应严格遵守良好的实验室规范和无菌工作条件。

事实上，即使是水凝胶的轻微污染也会对巨核细胞分化产生巨大影响。为了获得单孔水凝胶细胞培养物，首先在室温下解冻两个一毫升3%甲基纤维素等分试样，然后通过首先吸取一毫升然后将其全部排出来涂覆一毫升的Luer锁定注射器。接下来，使用相同的注射器和针头，从新鲜的等分试样中吸取333微升甲基纤维素。

小心地取出针头后，使用灭菌的镊子将鲁尔锁连接器拧到注射器的末端，然后将第二个未涂层的一毫升鲁尔锁注射器连接到连接器上。将甲基纤维素均匀地分布在两个注射器之间，并将它们放在一边。接下来，将先前分离的小鼠谱系阴性造血干细胞和祖细胞以每167微升10至6个细胞的密度重悬于浓缩培养基中。

断开其中一个注射器与连接器的连接，将167微升的细胞悬浮液直接移液到连接器中，同时缓慢地拉动注射器柱塞，为细胞悬浮液腾出空间。将所有电池悬架加入连接器后，进一步拉动柱塞以从连接器中取出悬架，并小心地重新连接第二个注射器，注意不要在螺纹中丢失任何悬架。为了用细胞悬浮液使甲基纤维素培养基均质化，在两个注射器之间缓慢来回移动柱塞10次，然后将总体积吸入一个注射器并断开两个注射器，将连接器留在空的连接器上。

将注射器的内容物倒入四孔板的一个孔中，并将板在5%二氧化碳下以37度孵育。为了分析丙酸盐，在培养的第三天，小心地将所有细胞从一个孔转移到含有10毫升DMEM和1%PSG的15毫升管中。通过轻轻移液以完全稀释甲基纤维素来重悬细胞，然后在室温下以300倍G离心管五分钟。

弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于一毫升完全培养基中，并以四孔板每孔500微升的量重新接种细胞。将板在37摄氏度下孵育在5%二氧化碳下。第二天，使用具有20倍物镜的明场显微镜，每孔随机获取10张图像，确保视野中没有太多细胞，并且每个视野至少捕获5个巨核细胞。

使用ImageJ，计算每张图像中巨核细胞和延伸丙酸盐细胞的总数，以计算延伸丙酸盐的巨核细胞的比例。为了固定细胞以供将来分析，请在不破坏凝胶的情况下将固定溶液添加到甲基纤维素的顶部。根据所使用的固定剂等待适当的时间后，使用P1000移液器轻轻移取固定剂和凝胶，直到甲基纤维素被均匀稀释。

并使用相同的移液器吸头，将孔中的所有内容物转移到含有10毫升DPBS的15毫升管中，并通过混合均质化。离心混合物。弃去上清液并将巨核细胞沉淀重悬于适合所需分析的培养基中。

到培养的第三天，液体培养基中的巨核细胞已经沉淀在孔的底部，并与坚硬的塑料表面以及其他细胞接触。相反，嵌入在甲基纤维素水凝胶中的细胞均匀分布并从相邻细胞中分离出来。对不同培养条件下巨核细胞平均直径的分析表明，与液体培养相比，2%甲基纤维素略微增加了巨核细胞的平均直径。

然而，将甲基纤维素浓度增加0.5%会损害巨核细胞分化，如平均直径较小所示。在具有代表性的透射电子显微镜图像中，骨髓内体内分化的巨核细胞中的胞浆内膜似乎与划定的细胞质区域紧密相反。在液体培养中，膜大多具有小的圆形椭圆形外观或细长的囊泡，没有细胞质区域的划界。

相比之下，2%甲基纤维素培养物与膜紧密相反，其分隔的细胞质区域类似于原位结构。到培养的第四天，与在液体培养基中培养的巨核细胞相比，先前在水凝胶中培养的巨核细胞显示出丙酸盐形成的增加。液体预培养物中扩展丙酸盐的巨核细胞的平均比例通常在15%至20%左右，而使用甲基纤维素水凝胶预培养物的平均比例为35%至40%。

在尝试此过程时，非常精确地移取适当体积非常重要，因为最终甲基纤维素浓度的微小变化会显着改变介质刚度。在水凝胶中细胞成熟后，可以通过流式细胞术回收巨核细胞以进行倍体和细胞标志物分析，或固定用于电子显微镜检查或目标蛋白质的免疫染色。