이 프로토콜은 네이티브 거대 카르요세포가 골수에서 그들의 행동과 성숙에 노출된 감금 및 중간 강성의 영향의 체외 평가를 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 세포 및 세포 매트릭스 상호 작용을 제거하고 기계적 측면에 초점을 맞춘 단순화 된 모델입니다. 좋은 실험실 실습 및 멸균 작업 조건은 엄격하게 관찰되어야 합니다.
실제로, 하이드로겔의 약간의 오염조차도 메가카요세포 분화에 극적인 영향을 미칠 수 있습니다. 하이드로겔 세포 배양의 단일 우물을 얻으려면 실온에서 3 % 메틸 셀룰로오스의 1 밀리리터 알리쿼트 2 개를 해동한 다음 먼저 1 밀리리터를 끌어서 메틸 셀룰로오스로 1 밀리리터 루어 잠금 주사기를 코팅한 다음 모든 것을 추방합니다. 다음으로, 동일한 주사기와 바늘을 사용하여 신선한 알리쿼트에서 메틸셀룰로오스 333 마이크로리터를 그립니다.
바늘을 조심스럽게 제거 한 후, 살균 된 집게를 사용하여 주사기 의 끝에 Luer 잠금 커넥터를 나사로 고정 한 다음 두 번째 비 코팅 된 1 밀리리터 Luer 잠금 주사기를 커넥터에 부착하십시오. 마찬가지로 두 주사기 사이에 메틸 셀룰로오스를 분배하고 따로 둡니다. 다음으로, 167마이크로리터당 6개의 세포에 10배의 밀도로 집중배양배지에서 이전에 격리된 마우스 계보 음성 조혈 줄기 및 전구세포를 재중단한다.
셀 서스펜션의 커넥터 및 파이펫 167 마이크로리터에서 주사기 중 하나를 커넥터에 직접 분리하는 동시에 주사기 플런저를 천천히 그리는 동시에 셀 서스펜션을 위한 공간을 마련합니다. 커넥터에 모든 셀 서스펜션을 추가한 후 플런저를 더 끌어내어 커넥터에서 서스펜션을 철회하고 두 번째 주사기를 조심스럽게 다시 연결하여 나사 스레드에서 서스펜션을 잃지 않도록 주의하십시오. 세포 현탁액으로 메틸셀룰로오스 배지를 균질화하려면 두 주사기 사이에 플런저를 10번 앞뒤로 천천히 이동한 다음 총 부피를 하나의 주사기로 끌어들이고 두 주사기를 분리하여 커넥터를 빈 상태로 둡시합니다.
주사기의 내용물들을 4웰 플레이트 한 웰에 비우고 이산화탄소 5% 미만의 37도에서 플레이트를 배양합니다. 프로플라슬을 분석하기 위해, 문화의 셋째 날에, 신중하게 1 %의 PSGDMEM의 10 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 모든 세포를 잘 전송합니다. 메틸셀룰로오스를 완전히 희석시키기 위해 부드럽게 파이펫팅하여 세포를 다시 중단한 다음 실온에서 300배 G에서 5분간 튜브를 원심분리합니다.
상체를 폐기한 후, 완전한 배양 배지의 1밀리리터로 세포 펠릿을 다시 중단하고 4웰 플레이트의 웰당 500 마이크로리터로 세포를 다시 시드한다. 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 다음 날, 20X 목표를 가진 브라이트 필드 현미경을 사용하여, 무작위로 잘 당 10 개의 이미지를 획득하여 시야에 너무 많은 세포를 가지고 있지 않도록하고 필드당 적어도 5 메가 카요사이클을 캡처합니다.
ImageJ를 사용하여 각 이미지에서 메가카요사이클의 총 수와 프로플라셋을 확장하는 것을 계산하여 프로플라셋을 확장하는 메가카요사이클의 비율을 계산합니다. 향후 분석을 위해 세포를 수정하려면 젤을 방해하지 않고 메틸셀룰로오스 위에 고정 솔루션을 추가합니다. 사용된 고정에 따라 적절한 시간을 기다린 후, P1000 파이펫을 사용하여 메틸셀룰로오스가 균질하게 희석될 때까지 고정 및 젤을 부드럽게 피펫합니다.
그리고 동일한 파이펫 팁을 사용하여, DPBS의 10 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 우물의 모든 내용을 전송하고 혼합하여 균질화. 혼합물을 원심분리합니다. 상체를 버리고 원하는 분석에 적합한 매체에서 메가카요세포 펠릿을 재연한다.
3일째배양문화시, 액체 배지의 거대카르요세포는 우물 의 바닥에 퇴적되어 딱딱한 플라스틱 표면뿐만 아니라 다른 세포와 접촉하고 있다. 대조적으로, 메틸셀룰로오스 하이드로겔에 내장된 세포는 동질적으로 분산되고 인접한 세포로부터 분리된다. 상이한 배양 조건 하에서 메가카요세포의 평균 직경을 분석한 결과, 2%메틸셀룰로오스가 액체 배양에 비해 평균 메가카요사이클지름을 약간 증가시킨다는 것을 보여준다.
그러나 메틸셀룰로오스 농도를 0.5% 증가시켜 평균 직경이 작아지는 메가카요사이클 분화를 손상시다. 대표적인 투과 전자 현미경 이미지에서, 골수 내의 생체내에서 분화된 거대 카르요세포의 내 트라이토플라심 막은 묘사된 세포질 계열과 밀접하게 반대되는 것으로 보인다. 액체 배양에서 멤브레인은 주로 세포질 영토의 제한없이 작은 둥근 타원형 모양또는 길쭉한 소포를 가지고 있습니다.
대조적으로, 2% 메틸셀룰로오스 배양은 시상 구조와 유사한 세포질 영토를 구분하는 막에 밀접하게 반대했습니다. 문화의 4일째에, 하이드로겔에서 이전에 배양된 거대 카르요세포는 액체 배지에서 배양된 것과 비교하여 프로플라틀 형성이 증가합니다. 프로플라츠를 확장하는 메가카요퀴트의 평균 비율은 메틸셀룰로오스 하이드로겔 프리 배양으로 35~40%에 비해 액체 사전 배양으로 약 15~20%이다.
이 절차를 시도할 때, 최종 메틸셀룰로오스 농도의 사소한 변화가 미디어 강성을 크게 수정할 수 있으므로 적절한 볼륨을 매우 정확하게 피펫하는 것이 중요합니다. 하이드로겔에서 세포 성숙에 이어, 메가카요세포는 혈중 세포측정을 통해 계피 및 세포 마커 분석을 위해 회수되거나 전자 현미경 검사또는 관심 있는 단백질의 면역염색을 위해 고정될 수 있다.
