Этот протокол позволяет in vitro оценить влияние удержания и жесткости среды, которой подвергаются нативные мегакариоциты в костном мозге, на их поведение и созревание. Основным преимуществом этой методики является упрощенная модель, которая исключает взаимодействие клетки и клеточной матрицы и фокусируется на механических аспектах. Надлежащая лабораторная практика и стерильные условия труда должны строго соблюдаться.
Действительно, даже незначительное загрязнение гидрогеля может оказать существенное влияние на дифференцировку мегакариоцитов. Чтобы получить одну лунку культуры гидрогелевых клеток, начните с размораживания двух аликвот в один миллилитр 3% метилцеллюлозы при комнатной температуре, затем покройте метилцеллюлозой один миллилитровый шприц Luer lock, сначала вытащая один миллилитр, а затем выталкивая его все. Далее, используя тот же шприц и иглу, вытянете 333 микролитра метилцеллюлозы из свежей аликвоты.
После осторожного извлечения иглы используйте стерилизованные щипцы, чтобы прикрутить разъем замка Luer к концу шприца, а затем прикрепите к разъему второй шприц с замком Luer без покрытия. Равномерно распределите метилцеллюлозу между двумя шприцами и отложите их в сторону. Затем повторно суспендируют ранее выделенные отрицательные гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки линии мыши в концентрированной культурально-питательной среде с плотностью от одного раза 10 до шести клеток на 167 микролитров.
Отсоедините один из шприцев от разъема и пипетки 167 микролитров клеточной подвески непосредственно в разъем, одновременно медленно втягивая плунжер шприца, чтобы освободить место для ячеистой подвески. После добавления всей ячеистой подвески в разъем, потяните плунжер дальше, чтобы вынуть подвеску из разъема и осторожно снова подключите второй шприц, заботясь о том, чтобы не потерять подвеску в резьбе винта. Чтобы гомогенизировать метилцеллюлозную среду с клеточной суспензией, медленно перемещайте плунжеры вперед и назад между двумя шприцами 10 раз, затем втягивайте общий объем в один шприц и отсоединяйте два шприца, оставляя разъем на пустом.
Опорожняйте содержимое шприца в один колодец четырехстворчатой пластины и инкубируют пластину при 37 градусах под 5% углекислого газа. Для анализа проплац, на третий день культуры аккуратно переложите все клетки из одной лунки в 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров ДМЭМ с 1% ПСГ. Повторно суспендируйте клетки, осторожно пипетируя, чтобы полностью разбавить метилцеллюлозу, затем центрифугируйте трубку в течение пяти минут при 300 раз G при комнатной температуре.
После выброса супернатанта повторно суспендируют клеточную гранулу в одном миллилитрах полной питательной среды и повторно засевают клетки по 500 микролитров на лунку четырехментной пластины. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия под 5% углекислого газа. На следующий день, используя микроскоп Брайтфилда с объективом 20X, случайным образом получите 10 изображений на скважину, убедившись, что в поле зрения не слишком много клеток и захватите не менее пяти мегакариоцитов на поле.
Используя ImageJ, подсчитайте общее количество мегакариоцитов и тех, которые расширяют проplatelets на каждом изображении, чтобы рассчитать долю мегакариоцитов, расширяющих проплацелеты. Чтобы зафиксировать клетки для будущих анализов, добавьте фиксаторный раствор поверх метилцеллюлозы, не нарушая работу геля. Подождав подходящее время в зависимости от используемого фиксатора, используйте пипетку P1000, чтобы аккуратно пипетку фиксатора и геля до тех пор, пока метилцеллюлоза не будет однородно разбавлена.
И используя тот же наконечник пипетки, переложить все содержимое скважины в 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров DPBS, и гомогенизировать путем перемешивания. Центрифугировать смесь. Выбросьте супернатант и повторно суспендьте гранулу мегакариоцитов в среде, подходящей для нужного анализа.
К третьему дню культуры мегакариоциты в жидкой среде оседают на дне скважины и контактируют с жесткой пластиковой поверхностью, а также с другими клетками. Напротив, клетки, встроенные в гидрогель метилцеллюлозы, равномерно распределены и изолированы от соседних клеток. Анализ среднего диаметра мегакариоцитов при различных условиях культивирования показывает, что 2% метилцеллюлозы незначительно увеличивает средний диаметр мегакариоцитов по сравнению с жидкой культурой.
Однако увеличение концентрации метилцеллюлозы на 0,5% ухудшает дифференцировку мегакариоцитов, о чем свидетельствует меньший средний диаметр. На репрезентативных изображениях просвечивающих электронных микроскопий интрацитоплазматические мембраны в мегакариоцитах, дифференцированных in vivo в костном мозге, по-видимому, тесно противоположны очерченным цитоплазматическим территориям. В жидкой культуре мембраны в основном имеют небольшой круглый овальный вид или удлиненные везикулы без разграничения цитоплазматических территорий.
Напротив, культура 2% метилцеллюлозы имеет тесно противоположные мембраны с разграничением цитоплазматических территорий, напоминающих структуру in situ. На четвертый день культивации мегакариоциты, ранее культивируемые в гидрогеле, показывают повышенное образование проплатлетов по сравнению с теми, которые культивируются в жидкой среде. Средняя доля мегакариоцитарных проплац, распространяющих проплацелеты, обычно составляет от 15 до 20% с жидким прекультурой по сравнению с 35-40% с предкультурным гидрогелем метилцеллюлозы.
При попытке этой процедуры важно очень точно пипетировать соответствующие объемы, так как незначительное изменение конечной концентрации метилцеллюлозы может значительно изменить жесткость среды. После созревания клеток в гидрогеле мегакариоциты могут быть восстановлены для анализа плоидии и клеточных маркеров с помощью проточной цитометрии или зафиксированы для электронной микроскопии или иммуноокрашивания интересующего белка.
