Este protocolo permite a avaliação in vitro do impacto do confinamento e da rigidez média a que megacariócitos nativos são expostos na medula óssea sobre seu comportamento e maturação. A principal vantagem dessa técnica é um modelo simplificado que elimina interações células-células e matrizes celulares e foca nos aspectos mecânicos. Boas práticas laboratoriais e condições de trabalho estéreis devem ser estritamente observadas.
De fato, mesmo uma ligeira contaminação do hidrogel pode ter um impacto dramático na diferenciação de megacaióte. Para obter um único poço de cultura de células de hidrogel, comece descongelando duas alíquotas de 3%de metilcelulose a temperatura ambiente, depois cubra uma seringa de bloqueio Luer de um mililitro com a metilcelulose, primeiro desenhando um mililitro e depois expulsando tudo. Em seguida, usando a mesma seringa e agulha, retire 333 microliters de metilcelulose de uma alíquota fresca.
Depois de remover cuidadosamente a agulha, use fórceps esterilizados para enroscar um conector de travar Luer na extremidade da seringa, em seguida, anexar uma segunda seringa de bloqueio Luer não revestida de mililitro ao conector. Distribua igualmente o metilcelulose entre as duas seringas e reserve-as. Em seguida, resuspenncie a linhagem de camundongos anteriormente isolada células-tronco hematopoiéticas e progenitoras no meio de cultura concentrada a uma densidade de uma vez 10 para as seis células por 167 microlitres.
Desconecte uma das seringas do conector e pipeta 167 microliters da suspensão celular diretamente no conector enquanto simultaneamente desenha o êmbolo da seringa lentamente para abrir espaço para a suspensão da célula. Depois de adicionar toda a suspensão da célula ao conector, retire ainda mais o êmbolo para retirar a suspensão do conector e reconecte cuidadosamente a segunda seringa, tomando cuidado para não perder nenhuma suspensão na rosca do parafuso. Para homogeneizar o meio de metilcelulose com a suspensão da célula, mova lentamente os êmbolos para frente e para trás entre as duas seringas 10 vezes, em seguida, desenhe o volume total em uma seringa e desconecte as duas seringas, deixando o conector no vazio.
Esvazie o conteúdo da seringa em um poço de uma placa de quatro poços e incubar a placa a 37 graus abaixo de 5% de dióxido de carbono. Para analisar proplatelets, no terceiro dia de cultura, transfira cuidadosamente todas as células de um poço para um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de DMEM com 1%PSG. Resuspenque as células tubondo suavemente para diluir completamente a metilcelulose, em seguida, centrífugue o tubo por cinco minutos a 300 vezes G à temperatura ambiente.
Depois de descartar o supernascer, resuspenque a pelota celular em um mililitro de cultura completa média e re-semente as células a 500 microliters por poço de uma placa de quatro poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius abaixo de 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, usando um microscópio Brightfield com um objetivo de 20X, adquira aleatoriamente 10 imagens por poço, certificando-se de não ter muitas células no campo de visão e capturando pelo menos cinco megacaiócitos por campo.
Usando ImageJ, conte o número total de megacaiócitos e aqueles que estendem proplatelets em cada imagem para calcular a proporção de megacaiócitos que estendem proplatelets. Para fixar as células para análises futuras, adicione a solução fixativa em cima da metilcelulose sem interromper o gel. Depois de esperar por um tempo adequado, dependendo do fixador utilizado, use uma pipeta P1000 para pipetar suavemente o fixador e o gel até que o metilcelulose tenha sido homogêneo diluído.
E usando a mesma ponta pipeta, transfira todo o conteúdo do poço para um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de DPBS e homogeneize por mistura. Centrifugar a mistura. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota de megacaióte em um meio apropriado para a análise desejada.
No terceiro dia de cultura, os megacaiócitos no meio líquido têm sedimentado na parte inferior do poço e estão em contato com a superfície plástica rígida, bem como outras células. Em contraste, as células embutidas no hidrogel de metilcelulose são distribuídas de forma homogênea e isoladas das células vizinhas. Uma análise do diâmetro médio dos megacaitos em diferentes condições culturais mostra que 2%de metilcelulose aumenta ligeiramente o diâmetro médio de megacariote em comparação com a cultura líquida.
No entanto, aumentar a concentração de metilcelulose em 0,5% prejudica a diferenciação de megacariócitos, como indicado por um diâmetro médio menor. Em imagens de microscopia eletrônica de transmissão representativa, as membranas intracytoplasmáticas em megacariócitos diferenciados in vivo dentro da medula óssea parecem ser intimamente opostas com territórios citoplasmados delineados. Na cultura líquida, as membranas têm principalmente uma pequena aparência oval redonda ou vesículas alongadas sem delimitação de territórios citoplasmados.
Em contraste, a cultura de 2% de metilcelulose tem se oposto intimamente às membranas com territórios citoplasmesmes delimitantes semelhantes à estrutura in situ. No quarto dia de cultura, os megacaiócitos previamente cultivados em hidrogel mostram aumento da formação de proplatelet em comparação com aqueles cultivados em meio líquido. A proporção média de megacaiocitas que estendem proplatelets é geralmente em torno de 15 a 20% com uma pré-cultura líquida em comparação com 35 a 40% com uma pré-cultura de hidrogel de metilcelulose.
Ao tentar este procedimento, é importante pipetar os volumes apropriados muito precisamente, pois uma pequena mudança na concentração final de metilcelulose pode modificar significativamente a rigidez da mídia. Após a maturação celular no hidrogel, megacariócitos podem ser recuperados para análise de ploidy e marcadorcelular por citometria de fluxo ou fixada para microscopia eletrônica ou imunossuagem de proteína de interesse.
