Ce protocole permet une évaluation in vitro de l’impact du confinement et de la rigidité moyenne auxquels les mégacaryocytes natifs sont exposés dans la moelle osseuse sur leur comportement et leur maturation. Le principal avantage de cette technique est un modèle simplifié qui élimine les interactions cellule-cellule et matrice cellulaire et se concentre sur les aspects mécaniques. Les bonnes pratiques de laboratoire et les conditions de travail stériles doivent être strictement respectées.
En effet, même une légère contamination de l’hydrogel peut avoir un impact dramatique sur la différenciation des mégacaryocytes. Pour obtenir un seul puits de culture cellulaire d’hydrogel, commencez par décongeler deux aliquotes d’un millilitre de méthylcellulose à 3% à température ambiante, puis enduire une seringue Luer lock d’un millilitre avec la méthylcellulose en dessinant d’abord un millilitre, puis en l’expulsant la totalité. Ensuite, à l’aide de la même seringue et de la même aiguille, prélez 333 microlitres de méthylcellulose à partir d’une aliquote fraîche.
Après avoir soigneusement retiré l’aiguille, utilisez une pince stérilisée pour visser un connecteur de verrouillage Luer à l’extrémité de la seringue, puis fixez une deuxième seringue de verrouillage Luer non revêtue d’un millilitre au connecteur. Répartissez également la méthylcellulose entre les deux seringues et mettez-les de côté. Ensuite, ressuspendez les cellules souches hématopoïétiques et progénitres négatives de la lignée de souris précédemment isolées dans le milieu de culture concentré à une densité d’une fois 10 à six cellules pour 167 microlitres.
Déconnectez l’une des seringues du connecteur et pipettez 167 microlitres de la suspension cellulaire directement dans le connecteur tout en tirant simultanément le piston de la seringue lentement pour faire de la place pour la suspension cellulaire. Après avoir ajouté toute la suspension de la cellule dans le connecteur, tirez davantage le piston pour retirer la suspension du connecteur et reconnectez soigneusement la deuxième seringue, en prenant soin de ne perdre aucune suspension dans le filetage de la vis. Pour homogénéiser le milieu méthylcellulose avec la suspension cellulaire, déplacez lentement les pistons d’avant en arrière entre les deux seringues 10 fois, puis aspirez le volume total dans une seringue et déconnectez les deux seringues, en laissant le connecteur vide.
Videz le contenu de la seringue dans un puits d’une plaque à quatre puits et incubez la plaque à 37 degrés sous 5% de dioxyde de carbone. Pour analyser les proplaquettaires, le troisième jour de la culture, transférez soigneusement toutes les cellules d’un puits dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de DMEM avec 1% de PSG. Resuspendez les cellules en pipetant doucement pour diluer complètement la méthylcellulose, puis centrifugez le tube pendant cinq minutes à 300 fois G à température ambiante.
Après avoir éliminé le surnageant, ressuspendez la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu de culture complet et réemencer les cellules à 500 microlitres par puits d’une plaque à quatre puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, à l’aide d’un microscope Brightfield avec un objectif 20X, acquérez au hasard 10 images par puits, en vous assurant de ne pas avoir trop de cellules dans le champ de vision et en capturant au moins cinq mégacaryocytes par champ.
À l’aide d’ImageJ, comptez le nombre total de mégacaryocytes et ceux qui étendent les proplaquettaires dans chaque image pour calculer la proportion de mégacaryocytes étendant les proplaquettaires. Pour fixer les cellules pour de futures analyses, ajoutez la solution fixatrice sur la méthylcellulose sans perturber le gel. Après avoir attendu un temps approprié en fonction du fixateur utilisé, utilisez une pipette P1000 pour pipeter doucement le fixateur et geler jusqu’à ce que la méthylcellulose ait été diluée de manière homogène.
Et en utilisant la même pointe de pipette, transférez tout le contenu du puits dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de DPBS et homogénéisez par mélange. Centrifuger le mélange. Jeter le surnageant et ressuspend la pastille de mégacaryocytes dans un milieu approprié pour l’analyse souhaitée.
Au troisième jour de la culture, les mégacaryocytes dans le milieu liquide ont sédimenté au fond du puits et sont en contact avec la surface plastique rigide, ainsi qu’avec d’autres cellules. En revanche, les cellules incorporées dans l’hydrogel de méthylcellulose sont réparties de manière homogène et isolées des cellules voisines. Une analyse du diamètre moyen des mégacaryocytes dans différentes conditions de culture montre que 2% de méthylcellulose augmente légèrement le diamètre moyen des mégacaryocytes par rapport à la culture liquide.
Cependant, l’augmentation de la concentration de méthylcellulose de 0,5% altère la différenciation des mégacaryocytes, comme l’indique un diamètre moyen plus petit. Dans les images de microscopie électronique à transmission représentative, les membranes intracytoplasmiques dans les mégacaryocytes différenciés in vivo dans la moelle osseuse semblent être étroitement opposées aux territoires cytoplasmiques délimités. En culture liquide, les membranes ont principalement un petit aspect ovale rond ou des vésicules allongées sans délimitation des territoires cytoplasmiques.
En revanche, la culture de méthylcellulose à 2% a étroitement opposé des membranes avec des territoires cytoplasmiques délimitant ressemblant à la structure in situ. Au quatrième jour de la culture, les mégacaryocytes précédemment cultivés dans l’hydrogel montrent une formation accrue de proplaquettaires par rapport à ceux cultivés en milieu liquide. La proportion moyenne de proplaquettaires prolongeant les mégacaryocytes est généralement d’environ 15 à 20% avec une pré-culture liquide contre 35 à 40% avec une pré-culture d’hydrogel de méthylcellulose.
Lors de la tentative de cette procédure, il est important de pipeter les volumes appropriés très précisément, car un changement mineur de la concentration finale de méthylcellulose peut modifier de manière significative la rigidité du milieu. Après maturation cellulaire dans l’hydrogel, les mégacaryocytes peuvent être récupérés pour l’analyse de la ploïdie et des marqueurs cellulaires par cytométrie en flux ou fixés pour la microscopie électronique ou l’immunocoloration de la protéine d’intérêt.
