このプロトコルは、天然の巨核球が骨髄内でそれらの挙動および成熟に曝される閉じ込めおよび中硬度の影響のインビトロ評価を可能にする。この手法の主な利点は、細胞とセルマトリックスの相互作用を排除し、機械的な側面に焦点を当てた簡略化されたモデルです。良い実験室の練習および無菌の労働条件は厳密に観察されるべきである。
実際、ヒドロゲルのわずかな汚染でさえ、巨核球分化に劇的な影響を与える可能性があります。ヒドロゲル細胞培養の単一のウェルを得るためには、室温で3%メチルセルロースの2つの1ミリリットルアリコートを解凍し、最初に1ミリリットルを引き出してすべてを排出することによって、メチルセルロースで1ミリリットルルアーロックシリンジをコーティングします。次に、同じ注射器と針を使用して、新鮮なアリコートから333マイクロリットルのメチルセルロースを引き出す。
針を慎重に取り外した後、滅菌鉗子を使用して、ルアーロックコネクタをシリンジの端にねじ込み、2番目の非コーティングされた1ミリリットルのルアーロックシリンジをコネクタに取り付けます。2つの注射器の間にメチルセルロースを均等に分配し、脇に置きます。次に、濃縮培養培地中の以前に単離されたマウス系統陰性造血幹細胞および前駆細胞を、167マイクロリットル当たり6細胞に10倍の密度で再懸濁する。
コネクターからスポイトの1つを取り外し、167マイクロリットルの細胞懸濁液をコネクタに直接取り出し、同時にシリンジプランジャーをゆっくりと引き出して細胞懸濁液のスペースを作ります。すべてのセル懸濁液をコネクタに追加した後、プランジャーをさらに引き出してコネクタから懸濁液を引き出し、2番目のシリンジを慎重に再接続し、スクリュースレッドの懸濁液を失わないように注意してください。メチルセルロース培地を細胞懸濁液で均質化するには、2つのシリンジの間を10回ゆっくりとスライプターを前後に動かし、合計体積を1つのシリンジに引き出し、2つの注射器を取り外し、コネクタを空のシリンジに残します。
4ウェルプレートの1つのウェルに注射器の内容物を空にし、5%の二酸化炭素の下で37度でプレートをインキュベートします。プロ血小板を分析するには、培養3日目に、1%PSGで10ミリリットルのDMEMを含む15ミリリットルチューブに1つの井戸からすべての細胞を慎重に移す。メチルセルロースを完全に希釈し、室温で300倍Gでチューブを5分間遠心分離して、細胞を穏やかにピペット化して再懸濁します。
上清を捨て、細胞ペレットを完全な培養培地の1ミリリットルで再懸濁し、4ウェルプレートのウェル当たり500マイクロリットルで細胞を再播種する。5%の二酸化炭素の下で摂氏37度でプレートをインキュベートします。翌日、20Xの目的を持つブライトフィールド顕微鏡を使用して、井戸あたり10枚の画像をランダムに取得し、視野に細胞が多すぎないようにし、フィールドごとに少なくとも5つの巨核球を捕獲します。
ImageJを使用して、各画像の巨核球の総数とプロメトレットを拡張するものを数え、プロ血小板を伸ばす巨核球の割合を計算する。将来の分析のために細胞を固定するには、ゲルを破壊することなくメチルセルロースの上に固定液を追加します。使用する固定剤に応じて適切な時間を待った後、P1000ピペットを使用して、メチルセルロースが均一に希釈されるまで固定液とゲルを穏やかにピペット化します。
同じピペットチップを使用して、10ミリリットルのDPBSを含む15ミリリットルのチューブに井戸のすべての内容物を移し、混合して均質化します。混合物を遠心分離します。上清を捨て、目的の分析に適した培地で巨核球ペレットを再懸濁する。
培養3日目までに、液体培地中の巨核球は井戸底で沈積し、硬いプラスチック表面と他の細胞と接触している。対照的に、メチルセルロースヒドロゲルに埋め込まれた細胞は、均一に分布し、隣接する細胞から単離される。異なる培養条件下での巨核球の平均直径の分析によると、2%メチルセルロースは液体培養物と比較して平均巨核球径をわずかに増加させる。
しかし、メチルセルロース濃度を0.5%上昇すると、小さな平均直径で示されるように巨核球分化が損なわれる。代表的な透過型電子顕微鏡画像では、骨髄内で生体内で分化した巨核球中の細胞内皮質膜は、線引き細胞質領域と密接に対立しているように見える。液体培養では、膜は、細胞質領域を区切ることなく、小さな丸い楕円形の外観または細長い小胞をほとんど有する。
対照的に、2%メチルセルロース培養は、in in situ構造に似た細胞質領域を区切る膜に密接に反対している。培養の4日目までに、ヒドロゲルで以前培養した巨核球は、液体培地で培養したものと比較してプロ血小板形成の増加を示す。プロメトレットを拡張する巨核球の平均割合は、メチルセルロースヒドロゲル前培養で35〜40%であったのに対し、液体前培養では通常15~20%程度である。
この手順を試みる場合、最終的なメチルセルロース濃度のわずかな変化がメディアの剛性を著しく変化させることができるので、適切な体積を極めて正確にピペットすることが重要である。ヒドロゲルにおける細胞成熟後、巨核球は、フローサイトメトリーによるプロイドおよび細胞マーカー解析のために回収されるか、または対象タンパク質の電子顕微鏡または免疫染色のために固定することができる。
