Questo protocollo consente la valutazione in vitro dell'impatto del confinamento e della rigidità media a cui i megacariociti nativi sono esposti nel midollo osseo sul loro comportamento e maturazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è un modello semplificato che elimina le interazioni cellula-cellula e matrice cellulare e si concentra sugli aspetti meccanici. Le buone pratiche di laboratorio e le condizioni di lavoro sterili devono essere rigorosamente osservate.
In effetti, anche una leggera contaminazione dell'idrogel può avere un impatto drammatico sulla differenziazione dei megacariociti. Per ottenere un singolo pozzo di coltura cellulare di idrogel, iniziare scongelando due aliquote di un millilitro del 3% di metilcellulosa a temperatura ambiente, quindi rivestire una siringa di blocco Luer da un millilitro con la metilcellulosa prima estraendo prima un millilitro e poi espellendolo tutto. Successivamente, utilizzando la stessa siringa e ago, prelevare 333 microlitri di metilcellulosa da un'aliquota fresca.
Dopo aver rimosso con cura l'ago, utilizzare una pinzaccia sterilizzata per avvitare un connettore Luer lock all'estremità della siringa, quindi collegare una seconda siringa Luer lock da un millilitro non rivestita al connettore. Distribuire equamente la metilcellulosa tra le due siringhe e metterle da parte. Successivamente, sospendare le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche negative del lignaggio di topo precedentemente isolate nel terreno di coltura concentrato ad una densità di una volta 10 alle sei cellule per 167 microlitri.
Scollegare una delle siringhe dal connettore e pipettare 167 microlitri della sospensione cellulare direttamente nel connettore mentre contemporaneamente si disegna lentamente lo stantuffo della siringa per fare spazio alla sospensione della cella. Dopo aver aggiunto tutta la sospensione della cella nel connettore, tirare ulteriormente lo stantuffo per prelevare la sospensione dal connettore e ricollegare con cura la seconda siringa, facendo attenzione a non perdere alcuna sospensione nella filettatura della vite. Per omogeneizzare il mezzo metilcellulosa con la sospensione cellulare, spostare lentamente gli stantuffi avanti e indietro tra le due siringhe 10 volte, quindi aspirare il volume totale in una siringa e scollegare le due siringhe, lasciando il connettore su quello vuoto.
Svuotare il contenuto della siringa in un pozzetti di una piastra a quattro pozzetti e incubare la piastra a 37 gradi sotto il 5% di anidride carbonica. Per analizzare i proplatelet, il terzo giorno di coltura, trasferire con cura tutte le cellule da un pozzo in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di DMEM con l'1% di PSG. Risuscilare le cellule mediante pipettaggio delicato per diluire completamente la metilcellulosa, quindi centrifugare il tubo per cinque minuti a 300 volte G a temperatura ambiente.
Dopo aver scartato il surnatante, risusegnare il pellet cellulare in un millilitro di terreno di coltura completo e riseminare le cellule a 500 microlitri per pozzetto di una piastra a quattro pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente, utilizzando un microscopio Brightfield con un obiettivo 20X, acquisire casualmente 10 immagini per pozzetto, assicurandosi di non avere troppe cellule nel campo visivo e catturando almeno cinque megacariociti per campo.
Usando ImageJ, conta il numero totale di megacariociti e quelli che estendono i proplatelet in ogni immagine per calcolare la proporzione di megacariociti che estendono i proplatelet. Per fissare le cellule per analisi future, aggiungere la soluzione fissativa sopra la metilcellulosa senza interrompere il gel. Dopo aver atteso un tempo adeguato a seconda del fissativo utilizzato, utilizzare una pipetta P1000 per pipettare delicatamente il fissativo e gel fino a quando la metilcellulosa non è stata diluita in modo omogeneo.
E usando la stessa punta della pipetta, trasferire tutto il contenuto del pozzo in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di DPBS e omogeneizzare mescolando. Centrifugare la miscela. Scartare il surnatante e risospendare il pellet di megacariociti in un mezzo appropriato per l'analisi desiderata.
Entro il terzo giorno di coltura, i megacariociti nel mezzo liquido si sono sedimentati sul fondo del pozzo e sono in contatto con la superficie plastica rigida, così come con altre cellule. Al contrario, le cellule incorporate nell'idrogel di metilcellulosa sono distribuite in modo omogeneo e isolate dalle cellule vicine. Un'analisi del diametro medio dei megacariociti in diverse condizioni di coltura mostra che il 2% di metilcellulosa aumenta leggermente il diametro medio dei megacariociti rispetto alla coltura liquida.
Tuttavia, l'aumento della concentrazione di metilcellulosa dello 0,5% compromette la differenziazione dei megacariociti come indicato da un diametro medio più piccolo. Nelle immagini rappresentative di microscopia elettronica a trasmissione, le membrane intracitoplasmatiche nei megacariociti differenziati in vivo all'interno del midollo osseo sembrano essere strettamente opposte ai territori citoplasmatici delineati. In coltura liquida, le membrane hanno per lo più un piccolo aspetto ovale rotondo o vescicole allungate senza delimitazione dei territori citoplasmatici.
Al contrario, la coltura del 2% di metilcellulosa si è opposta strettamente alle membrane con territori citoplasmatici delimitanti simili alla struttura in situ. Entro il quarto giorno di coltura, i megacariociti precedentemente coltivati in idrogel mostrano una maggiore formazione di proplatelet rispetto a quelli coltivati in mezzo liquido. La proporzione media di proplati che estendono i megacariociti è di solito intorno al 15-20% con una pre-coltura liquida rispetto al 35-40% con una pre-coltura di idrogel di metilcellulosa.
Quando si tenta questa procedura, è importante pipettare i volumi appropriati in modo molto preciso poiché una piccola variazione della concentrazione finale di metilcellulosa può modificare significativamente la rigidità del mezzo. Dopo la maturazione cellulare nell'idrogel, i megacariociti possono essere recuperati per l'analisi della ploidia e dei marcatori cellulari mediante citometria a flusso o fissati per microscopia elettronica o immunocolorazione di proteine di interesse.
