该方案旨在获得大量源自骨髓且从未暴露于组织因子或细胞因子的未刺激巨噬细胞。该技术的主要优点是从单个动物获得的细胞数量。通过正确的程序，可以获得大约 2 乘以 10 的 7 个巨噬细胞的幂。
这种方法可以帮助来自不同领域的研究人员研究巨噬细胞，如细胞生物学、病理学、免疫学和寄生虫学，因为细胞总是容易受到污染，所以对所有无菌步骤都要小心并使用层流生物安全柜来维持细胞活力。演示该程序的是伊莎贝拉·阿帕雷西达·德·索萨（Izabela Aparecida de Souza）。我们实验室的硕士研究生。
为了在适当安乐死的八周龄C57BL / 6野生型雄性小鼠上开始该程序，将小鼠浸泡在70%乙醇溶液中。使用无菌剪刀，沿着腹部切开一厘米的切口，然后去除皮肤，直到后腿的肌肉完全暴露。然后小心地在髋部高度移除后腿，不要折断股骨和胫骨。
将完整的后腿放入含有70%乙醇溶液的锥形离心管中。在层流生物安全柜内，将分离的腿从 70% 乙醇转移到无菌 PBS 中。使用镊子和消毒湿巾，通过去除所有附着的肌肉和筋膜来清洁骨骼。
然后，使用无菌外科手术刀刀片切开两端的骨骺，露出骨髓。用 10 毫升无菌 PBS 填充 2% 青霉素链霉素溶液填充 20 毫升注射器，并将 26 号针头连接到其上。用一只手使用解剖解剖钳握住骨头。
用另一只手小心地将针头插入骨腔，不要压碎骨头。然后，用PBS洗掉骨头内部，并将骨髓收集在无菌锥形离心管中。清洗后，骨腔应呈白色。
将收集的细胞以 300G 和 4 摄氏度离心 10 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于一毫升DMEM / F1210培养基中。使悬浮液均质化，并再加入 9 毫升培养基，使总体积达到 10 毫升。
将 1 毫升祖细胞悬浮液加入 10 个圆形塑料培养皿中，尺寸为 100 毫升乘 20 毫米。用移液管将细胞铺在板上以获得均匀的分布。然后，向每个培养皿中加入 9 毫升补充有 20% L929 细胞上清液的 DMEM/F1210。
将培养皿置于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下。第三天，向每个培养皿中加入 10 毫升补充有 20% L929 细胞上清液的 DMEM/F1210 培养基。每个培养皿中产生的 20 毫升培养基足以用于细胞生长直至成熟。
从所有培养皿中丢弃上清液。用预热至 37 摄氏度的 10 毫升无菌无镁和无钙 PBS 洗涤每个培养皿，洗涤后丢弃溶液。向每个培养皿中加入 3 毫升预热至 37 摄氏度的非酶促细胞解离溶液。
在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 10 分钟。然后，使用倒置显微镜观察巨噬细胞是否从细胞培养皿中解离。使用血清移液管，用非酶促细胞解离溶液清洗餐具，反复进行圆周运动，以确保巨噬细胞完全解离。
从所有培养皿中收集溶液并将其合并到50毫升锥形离心管中。再次，将 10 毫升无菌预热的 PBS 添加到空培养皿中。将装有混合收集溶液的锥形管在 300 G 和 4 摄氏度下离心 10 分钟。
弃去上清液，用一毫升DMEM / F1210重悬沉淀。通过上下移液缓慢而小心地匀浆悬浮液，而不会损坏细胞。通过加入 10 微升台盼蓝稀释 10 微升巨噬细胞溶液的等分试样，使用血细胞计数器对细胞进行计数。
在第七天，每个培养皿将产生大约200万个巨噬细胞。暴露于 L929 上清液中的巨噬细胞集落刺激因子后，骨髓祖细胞逐渐转变为成熟的巨噬细胞，由于细胞质延伸，表现出典型的扩散形态。在第三天，出现了一些未成熟的巨噬细胞，具有典型的圆形形态，几乎没有膜突起。
尽管他们在整个过程中发生了变化，但要达到足够的数量和成熟度，需要七天时间。在流式细胞术分析中，获得的巨噬细胞在大小和粒度方面显示出均匀的群体。此外，100% 的细胞群表达特征性的 F480 和 CD11B 表面分子，形成一个单一的明确细胞群。
荧光显微镜图像证实了成熟且分化良好的巨噬细胞的吞噬能力，该图像显示巨噬细胞内的吞噬利什曼原虫主要寄生虫。应小心地从动物身上取下腿，因为它是在非无菌环境中进行的，并且是最重要的污染源。支腿不得在层流生物安全柜外折断。
从该协议获得的骨髓来源的巨噬细胞可用于随后进行巨噬细胞体外极化以了解巨噬细胞生理学。
