在本视频中，我们将展示如何使用数字液滴PCR方法量化小鼠视网膜中的AAV转导，该方法非常灵敏，可以对目标DNA进行绝对定量。我们开发了这种方法，主要用于大型AVV构建体，不允许我们使用像基于CRISPR的构建体这样的报告基因。通过使用这种方法，我们可以简单地量化视网膜中AAV的转导率。
该方法依赖于数字液滴PCR的灵敏度和绝对定量，并产生直接的结果。在本视频中，我们将展示如何使用数字液滴PCR方法量化小鼠视网膜中的AAV转导，该方法非常灵敏，可以对目标DNA进行绝对定量。我们已经开发了这种方法，主要用于大面积构建体，不允许我们使用像基于CRISPR的构建体这样的报告基因。
通过使用这种方法，我们可以简单地量化视网膜中AAV的转导率。该方法依赖于两个液滴PCR的灵敏度和绝对定量，并产生直接的结果。由于数字液滴PCR方法的效率，一些实验室已经从定量实时荧光定量PCR转向数字液滴PCR或AAV滴定。
该方法还可以为视网膜中的线粒体DNA定量提供基础，以及检查基于CRISPR的突变校正对小鼠视网膜基因治疗的效率。用AAV辅助质粒，AAV衣壳质粒，AAV载体和PI溶液制备5毫升所需的转染混合物。将制备的5毫升转染混合物加入培养基中。
在37摄氏度下孵育转染的细胞。在转染后 48 至 60 小时收集培养基。用DNA以每毫升250单位的终浓度在37摄氏度下消化30分钟，并在4， 000 g 4摄氏度下离心30分钟。
用PBS预润湿再生纤维素膜。用0.22微米注射器过滤器过滤介质，放入预润湿的再生纤维素膜中，共过滤100千道尔顿。将再生纤维素膜在4，000 G四摄氏度下离心30分钟并丢弃培养基。
用含有0.001%pluronic F68的PBS洗涤再生纤维素膜并在4000 G 4摄氏度下离心三次30分钟。从再生纤维素膜的顶部收集浓缩的AAV并分配以供进一步使用。在这里，我们展示了如何进行小规模的AAV生产。
在审查此协议后，您应该能够制作足以看到视网膜中报告者表达的AVV。您也可以遵循数字PCR的实验方案，以便能够滴定产生的AAV。麻醉前涂抹一滴含有0.5%托吡卡胺和2.5%去氧肾上腺素盐酸盐的眼药水，以扩张瞳孔。
用异氟醚麻醉小鼠并验证反射。在注射程序之前，将0.3%妥布霉素和0.1%地塞米松无菌眼药溶液滴眼液涂抹在每只眼睛上。使用手术钩稳定上眼睑。
稍微向后拉，露出眼睛的背侧部分。将挂钩用胶带固定在带上以保持到位。用弯曲的虹膜剪刀去除结膜，露出眼睛的巩膜。
使用新鲜无菌的30G胰岛素注射器刺穿巩膜。使用微型机械手将微型注射器的针头通过相同的穿刺插入。将针尖放在眼罩中间的晶状体后面。
将一微升AAV溶液缓慢注入眼睛的玻璃体中。将针头留在原位一分钟，然后慢慢取出针头。将含有0.3%妥布霉素和0.1%地塞米松的抗炎和抗菌局部凝胶治疗应用于眼罩。
涂抹一滴0.5%托吡卡胺。和含有2.5%去氧肾上腺素盐酸盐的滴眼液在麻醉前扩张瞳孔。将每克外用凝胶2毫克的尿素涂抹在眼睛表面。
根据需要调整鼠标支架以将鼠标眼睛居中。在玻璃体内注射后一周和两周对双眼进行眼底和荧光成像，以跟踪TdTomato表达。在手术前使用二氧化碳吸入对动物实施安乐死。
在13.5厘米的分离器镊子的帮助下将眼球向前移动。取出晶状体和剩余的玻璃体。用精密弯曲的镊子切断眼球与视神经的连接，并使用相同的弯曲镊子轻轻挤压视网膜。
使用商业化的蛋白酶K消化膜组织基因组DNA试剂盒分离基因组DNA。用蛋白酶K.Lyse视网膜在55摄氏度200 G下完全消化视网膜30分钟，并遵循制造商的protocol。在这些实验方案中，我们显示了玻璃体内注射眼底荧光成像，以及视网膜和基因组DNA分离。
这些是视网膜非常关键的程序，通过遵循此方案，您应该能够注射产生的AAV并随访其表达谱。并通过量化视网膜基因组DNA中的AAV基因组来提高转导效率。在这里，您可以看到数字液滴PCR的基本应用，您可以在其中对在视网膜细胞中转导的AAV基因组进行绝对定量。
将注射的视网膜中的基因组DNA稀释到0.05%pluronic F 68溶液中，以达到每个样品每微升1纳克的终浓度。在20微升PCR反应混合物中进行液滴生成，包括一个纳克基因组DNA 125纳米摩尔引物和2X常绿超级混合物。将样品混合物加载到墨盒的中间部分以产生液滴。
然后将70微升液滴生成油加入底排墨盒中。将垫圈放在墨盒顶部。确保垫圈和墨盒之间没有间隙。
然后将其放入液滴发生器中。轻轻取顶部铃铛中产生的约40微升液滴。将液滴溶液加入半裙边96孔PCR反应板中。
使用铝密封箔用PCR板密封器密封PCR板。将PCR板放入96孔热封热循环仪中。使用本文中指示的 ddPCR 协议。
将PCR板放入液滴读数仪中以分析数据。观看此视频后，您应该能够执行基本的数字PCR技术。您也可以使用含有少量物质的受累细胞，这是数字PCR技术的理想选择。
但是，应仔细调整目标DNA量，使其不超过数字液滴PCR的限值。以下是实验过程的流程图。我们进行了小规模的AAV生产，随后进行了AAV滴定。
然后我们进行了玻璃体内注射。之后，我们通过眼底荧光成像量化了荧光强度。然后分离小鼠视网膜并从视网膜中提取基因组DNA用于ddPCR。
滴定 AAV 对于正确量化 AAV 转导也至关重要。ddPCR依赖于稀释目标AAV基因的液滴的产生。具有代表性的ddPCR结果显示AVV基因组的阳性和阴性液滴。
高于阈值的正数和负数低于阈值。在与稀释因子相乘后，发现AAV的滴度为每毫升基因组拷贝中的10至12。为了正确量化AAV转导效率，注射了几个视网膜。
对注射的动物进行成像，并计算荧光平均强度。在两周的时间点，分离出视网膜。ddPCR是使用WPRE和18 S引物进行的。
AAV注射视网膜的荧光强度与AAV基因组计算相关，显示了该方法的强大功能。在这里，我们展示了几种技术，包括小规模AAV制备玻璃体内注射。
