En este vídeo, mostraremos cómo cuantificar la transducción de AAV en la retina del ratón utilizando el método de PCR de gotas digitales, que es extremadamente sensible y hace una cuantificación absoluta del ADN objetivo. Hemos desarrollado este método principalmente para grandes construcciones AVV que no nos permiten usar un gen reportero como las construcciones basadas en CRISPR. Mediante el uso de este método, podemos simplemente cuantificar la tasa de transducción de AAV en la retina.
Este método se basa en la sensibilidad y la cuantificación absoluta de la PCR de gotas digitales y produce resultados directos. En este vídeo, mostraremos cómo cuantificar la transducción de AAV en la retina del ratón utilizando el método de PCR de gotas digitales, que es extremadamente sensible y hace una cuantificación absoluta del ADN objetivo. Hemos desarrollado este método principalmente para construcciones de área grande que no nos permite usar un gen reportero como las construcciones basadas en CRISPR.
Mediante el uso de este método, podemos simplemente cuantificar la tasa de transducción de AAV en la retina. Este método se basa en la sensibilidad y la cuantificación absoluta de las dos gotas de PCR y produce resultados directos. Debido a la eficiencia de la metodología de PCR de gotas digitales, varios laboratorios ya cambian de PCR cuantitativa en tiempo real a PCR digital de gotas o titulación AAV.
Este método también puede proporcionar una base para la cuantificación del ADN mitocondrial en la retina, así como para verificar la eficiencia de la corrección de mutaciones basada en CRISPR para la terapia génica en la retina del ratón. Prepare la mezcla de transfección con el plásmido auxiliar AAV, el plásmido de la cápside AAV, el vector AAV y la solución PI en cinco mililitros de demanda. Agregue la mezcla de transfección preparada de cinco mililitros en los medios de cultivo.
Incubar células transfectadas a 37 grados centígrados. Recoger los medios de comunicación a las 48 a 60 horas después de la transfección. Digiera el medio con ADN a una concentración final de 250 unidades por mililitro durante 30 minutos a 37 grados centígrados y centríelo a 4.000 g cuatro grados centígrados durante 30 minutos.
Mojar previamente la membrana de celulosa regenerada con PBS. Filtre el medio con un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros en la membrana de celulosa regenerada prehumedida para 100 kilos daltons. Centrifugar la membrana de celulosa regenerada a 4.000 G cuatro grados centígrados durante 30 minutos y desechar el medio.
Lavar y centrifugar la membrana de celulosa regenerada con PBS que contiene 0.001% plurónico F68 tres veces a 4000 G cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Recoger los AAV concentrados de la parte superior de la membrana de celulosa regenerada y asignarlos para su uso posterior. Aquí mostramos cómo hacer una producción AAV a menor escala.
Después de examinar este protocolo, debería poder hacer AVV que sean suficientes para ver la expresión del reportero en la retina. También puede seguir el protocolo de PCR digital para poder titular los AAV producidos. Aplique una gota de 0,5% de tropicamida y 2,5% de clorhidrato de fenilefrina que contenga gotas para los ojos antes de la anestesia para dilatar las pupilas.
Anestesiar ratones con isoflurano y verificar los reflejos. Aplique gotas oftálmicas estériles de solución oftálmica al 0,3% y 0,1% de dexametasona en cada ojo antes del procedimiento de inyección. Use el gancho quirúrgico para estabilizar el párpado superior.
Tire ligeramente hacia atrás para exponer la parte dorsal del ojo. Pega el gancho a la banda para mantenerlo en posición. Retire la conjuntiva con las tijeras de iris curvo para exponer la esclerótica del ojo.
Use una jeringa de insulina 30G fresca y estéril para perforar la esclerótica. Inserte la aguja de la micro jeringa a través de la misma punción utilizando un micromanipulador. Coloque la punta de la aguja detrás de la lente en el centro de la copa del ojo.
Inyecte un micro litro de solución AAV lentamente en el vítreo del ojo. Deje la aguja en su lugar durante un minuto y retire lentamente la aguja. Aplique un tratamiento de gel tópico antiinflamatorio y antibacteriano que contenga 0,3% de tobramicina y 0,1% dexametasona en la copa del ojo.
Aplique una gota de 0.5% tropicamide. Y clorhidrato de fenilefrina al 2,5% que contiene colirio antes de la anestesia para dilatar las pupilas. Aplique carbamida dos miligramos por gramo de gel tópico sobre la superficie de los ojos.
Ajuste el soporte del ratón según sea necesario para centrar el ojo del ratón. Realice imágenes de fondo de ojo y fluorescencia en ambos ojos para seguir la expresión de TdTomato una semana y dos semanas después de la inyección intravítrea. Eutanasia a los animales usando la inhalación de dióxido de carbono antes del procedimiento.
Desplace el globo ocular hacia adelante con la ayuda de una pinza divisora de 13,5 centímetros. Retire la lente junto con el vítreo sobrante. Corte la conexión del globo ocular al nervio óptico con un fórceps curvo de precisión y apriete suavemente la retina con las mismas pinzas curvas.
Aísle el ADN genómico con un kit de ADN genómico tisómico basado en película de digestión de proteinasa K comercializado. Digiera la retina a 55 grados Celsius 200 G durante 30 minutos con la proteinasa K.Lyse retina por completo y siga el protocolo del fabricante. En estos protocolos, hemos mostrado imágenes de florescencia del fondo de ojo de inyección intravítrea, así como aislamiento de retina y ADN genómico.
Estos son procedimientos muy críticos para la retina, y al seguir este protocolo, debería poder inyectar los AV producidos y hacer un seguimiento de su perfil de expresión. Y cucharón esa eficiencia de transducción cuantificando los genomas de AAV en el ADN genómico de la retina. Aquí, puedes ver la aplicación básica de la PCR digital de gotas, donde puedes hacer una cuantificación absoluta del genoma AAV que transducen en las células de la retina.
Diluir los ADN genómicos de las retinas inyectadas en solución F 68 al 0,05% plurónica para alcanzar una concentración final de un nanogramo por microlitro para cada muestra. Realice la generación de gotas en una mezcla de reacción de PCR de 20 microlitros, que incluye un nanogramo de ADN genómico 125 nanomolares y una súper mezcla de hoja perenne 2X. Cargue la mezcla de muestras en la parte media del cartucho para la generación de gotas.
Luego agregue aceite de generación de gotas de 70 microlitros en la fila inferior del cartucho. Coloque la junta encima del cartucho. Asegúrese de que no haya espacio entre la junta y el cartucho.
Luego colóquelo en el generador de gotas. Tome suavemente aproximadamente 40 microlitros de gotas que se generan en la campana superior. Agregue la solución de gotas a la placa de reacción de PCR semifaldada de 96 pocillos.
Selle la placa de PCR con un sellador de placas de PCR utilizando papel de sellado de aluminio. Coloque la placa de PCR en el termociclador termosellado de 96 pocillos. Utilice el protocolo ddPCR indicado en el artículo.
Coloque la placa de PCR en el lector de gotas para analizar los datos. Después de ver este video, debería poder realizar una técnica básica de PCR digital. También puede utilizar células ejercidas con pequeñas cantidades de material, lo que es ideal para la técnica de PCR digital.
Sin embargo, debe ajustar cuidadosamente la cantidad de ADN objetivo para no exceder el límite de la PCR de gotas digitales. Aquí está el diagrama de flujo para el procedimiento experimental. Realizamos la producción de AAV a pequeña escala, que es seguida por la titulación de AAV.
Luego se realizó la inyección intravítrea. Posteriormente, cuantificamos la intensidad fluorescente mediante imágenes de fluorescencia del fondo de ojo. Luego se aislaron las retinas de ratón y se extrajo ADN genómico de las retinas para ddPCR.
El AAV de titulación también es fundamental para poder cuantificar correctamente la transducción de AAV. ddPCR depende de la generación de gotas que ha diluido el genom AAV objetivo. Los resultados representativos de ddPCR muestran gotas positivas y negativas para el genoma avV.
Positivo por encima del umbral y negativo está por debajo. Después de multiplicarse con los factores de dilución, se encontró que el título de los AAV era de 10 a 12 en copias del genoma por mililitro. Para cuantificar correctamente la eficiencia de la transducción de AAV, se inyectaron varias retinas.
Se tomaron imágenes de animales inyectados y se calculó la intensidad media de fluorescencia. A las dos semanas, se aislaron las retinas. Y la ddPCR se realizó utilizando cebadores WPRE y 18 S.
La intensidad de fluorescencia de las retinas inyectadas con AAV se correlacionó con los cálculos del genoma de AAV, mostrando el poder de la metodología. Aquí, hemos mostrado varias técnicas, incluida la inyección intravítrea de preparación de AAV a pequeña escala.
