このビデオでは、非常に感度が高く、標的DNAの絶対定量を行うデジタル液滴PCR法を用いて、マウスのAAV伝達を定量化する方法を紹介します。我々は、主にCRISPRベースの構築物のようなレポーター遺伝子を使用することを許可しない大きなAVV構造のためにこの方法を開発しました。この方法を用いることで、単にRetinaでのAAVのトランスダクション率を定量化することができます。
この方法は、デジタル液滴PCRの感度と絶対定量に依存し、まっすぐな結果をもたらします。このビデオでは、非常に感度が高く、標的DNAの絶対定量を行うデジタル液滴PCR法を用いて、マウスのAAV伝達を定量化する方法を紹介します。我々は、主にCRISPRベースの構築物のようなレポーター遺伝子を使用することを可能にしない大きな領域構造のためにこの方法を開発しました。
この方法を用いることで、単にRetinaでのAAVのトランスダクション率を定量化することができます。この方法は、感度と2つの液滴PCRの絶対定量に依存し、まっすぐな結果を得る。デジタル液滴 PCR 手法の効率により、定量的リアルタイム PCR からデジタル液滴 PCR または AAV 滴定に切り替える研究所がいくつか存在します。
この方法はまた、マウスのretinaにおける遺伝子治療のためのCRISPRベースの突然変異補正の効率をチェックするとともに、レティナにおけるミトコンドリアDNA定量の基礎を提供することができる。AAVヘルパープラスミド、AAVカプシドプラスミド、AAVベクター、およびPI溶液を5ミリリットルの要求でトランスフェクション混合物を調製します。5ミリリットルのトランスフェクション混合物を培養培地に加えます。
37°Cでトランスフェクトされた細胞をインキュベートします。トランスフェクション後48~60時間でメディアを収集します。37°Cで30分間、30分間、30分間摂氏4,000gで遠心分離機で30分間、1ミリリットル当たり250単位の最終濃度でDNAでメディアを消化します。
再生セルロース膜をPBSで予水した。0.22マイクロメートルのシリンジフィルターで、100キロダルトンの予め湿った再生セルロース膜に培地をフィルターします。再生セルロース膜を4,000Gで摂氏4度で30分間遠心し、培地を廃棄する。
再生セルロース膜を4000G4°Cで3回3回で0.001%pluronic F68を含むPBSで再生セルロース膜を30分間洗浄し、遠心分離します。再生セルロース膜の上部から濃縮されたAAVを収集し、さらなる使用のために割り当てます。ここでは、より小規模なAAV生産を行う方法を示しました。
このプロトコルを確認した後、あなたは、retinaでレポーターの表現を見るのに十分なAVを作ることができるはずです。また、デジタル PCR のプロトコルに従って、AAV を生産する機能を実現することもできます。0.5%のトロピックアミドと2.5%フェニレフリン塩酸塩の1滴を適用し、瞳孔を拡張するために麻酔前に眼球滴を含む。
イソフルランでマウスを麻酔し、反射神経を検証する。0.3%トブラマイシンと0.1%デキサメタゾン滅菌オフサルミック溶液の点眼を注射術前に各眼に塗布する。上まぶたを安定させるために外科用フックを使用してください。
わずかに引き戻して、目の背側部分を露出させます。フックをバンドにテープで貼り付け、位置に保持します。湾曲した虹彩はさみで結膜を取り除き、眼の膜を露出させます。
新鮮で無菌の30Gインスリン注射器を使用して、スクレラを穿刺します。マイクロマニピュレータを使用して、同じ穿刺を通してマイクロシリンジの針を挿入します。レンズの後ろの針の先端を、アイカップの中央に置きます。
目の膜内にゆっくりとAAV溶液の1マイクロリットルを注入します。針を1分間所定の位置に置いておき、ゆっくりと針を引き出します。0.3%トブラマイシンと0.1%デキサメタゾンを含む抗炎症および抗菌局所ゲル処理をアイカップに適用する。
0.5%トロピックアミドを1滴下適用してください。そして、2.5%フェニレフリン塩酸塩は、瞳孔を拡張するために麻酔前に目のドロップを含む。目の表面に1グラムの局所ゲルあたりカルバミド2ミリグラムを適用します。
マウスの目を中央に合わせるには、必要に応じてマウススタンドを調整します。両眼に眼深さと蛍光イメージングを行い、細胞内注射の1週間と2週間後にTdTomato発現を行います。手順の前に二酸化炭素吸入を使用して動物を安楽死させる。
13.5センチメートルのスプリッター鉗子の助けを借りて前方に目の球をシフト。残ったガラス膜と一緒にレンズを取り外します。精密湾曲した鉗子で眼球と視神経の接続を切断し、同じ湾曲した鉗子で静かに眼球の接続を切断します。
ゲノムDNAを、製品化プロテイナーゼK消化膜ベースの組織DNAキットで分離します。55°Cでレティナを30分間30分間消化し、プロテイナーゼK.Lyse retinaを使用し、メーカーのプロトコルに従ってください。これらのプロトコルでは、細胞内注入眼球イメージング、ならびにレティナおよびゲノムDNA分離を示している。
これらは retina にとって非常に重要な手順であり、このプロトコルに従うことで、生産された AAV を注入し、その式プロファイルをフォローアップできるはずです。そして、その点を、AAVゲノムを遺伝子組換え遺伝子で定量することにより、その伝達効率を高める。ここでは、デジタル液滴PCRの基本的な応用を見ることができ、そこでは、細胞の中でトランスデュースするAAVゲノムの絶対定量化を行うことができます。
0.05%pluronic F 68溶液に注入されたレチナからの希薄なゲノムDNAは、各サンプルに対してマイクロリットル当たり1ナノグラムの最終濃度に達する。1ナノグラムゲノムDNA125ナノモルプライマーと2X常緑スーパーミックスを含む20マイクロリットルのPCR反応ミックスで液滴生成を行います。液滴生成のためにカートリッジの中央部にサンプルミックスをロードします。
その後、カートリッジの下段に70マイクロリットルの液滴発生油を加えます。カートリッジの上にガスケットを置きます。ガスケットとカートリッジの間に隙間がないことを確認します。
その後、液滴発生器に配置します。上のベルに発生する約40マイクロリットルの液滴をそっと取ります。セミスカート96-ウェルPCR反応プレートに液滴溶液を追加します。
PCR プレートを、アルミ製シールホイルを使用してシーラー PCR でシールします。PCR プレートを 96 ウェルヒートシールサーマルサイクラーに入れます。この記事で示されている ddPCR プロトコルを使用します。
PCR プレートを液滴リーダーに入れてデータを分析します。このビデオを見た後、基本的なデジタル PCR 技術を実行できるはずです。少量の材料を含む細胞を使用することも可能で、デジタル PCR 技術に最適です。
ただし、デジタル液滴 PCR の限界を超えないようにターゲット DNA 量を慎重に調整する必要があります。実験手順のフローチャートを次に示します。小規模なAAV生産を行い、その後AAVの引き起こしを行いました。
その後、細胞内注射を行いました。その後、眼深蛍光イメージングによる蛍光強度を定量化しました。その後、マウスのレティナを単離し、ddPCR用のレティナからゲノムDNAを抽出した。
Titering AAV は、AAV の変換を正しく定量化できることも重要です。ddPCRは、標的AAVジェノムを希釈した液滴の生成に依存する。代表的なddPCRの結果は、AVVゲノムの正および負の液滴を示す。
しきい値を超える正の値と負の値は以下です。希釈因子を掛けた後、AAVの価率は1ミリリットル当たりのゲノムコピーで10〜12であることがわかった。AAVトランダクション効率を正しく定量するために、いくつかのレチナを注入した。
注射した動物を画像化し、蛍光平均強度を算出した。2週間の時点で、レティナは単離された。ddPCRはWPREおよび18Sプライマーを用いて行った。
AAV注入されたレティナの蛍光強度は、AAVゲノム計算と相関し、方法論の力を示した。ここでは、小規模なAAV調製イントラビクテル注射を含むいくつかの技術を示した。
