이 비디오에서는 매우 민감하고 대상 DNA의 절대 적인 정량화를 수행하는 디지털 물방울 PCR 방법을 사용하여 마우스 망막에서 AAV 변환을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 우리는 우리가 CRISPR 기반 구조같이 기자 유전자를 사용하는 것을 허용하지 않는 큰 AVV 구조물을 위해 주로 이 방법을 개발했습니다. 이 방법을 사용하면 망막에서 AAV의 변환 속도를 정량화할 수 있습니다.
이 방법은 디지털 물방울 PCR의 감도 및 절대 정량화에 의존하며 곧바로 결과를 산출합니다. 이 비디오에서는 매우 민감하고 대상 DNA의 절대 적인 정량화를 수행하는 디지털 물방울 PCR 방법을 사용하여 마우스 망막에서 AAV 변환을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 우리는 우리가 CRISPR 기반 구조같이 기자 유전자를 사용하는 것을 허용하지 않는 큰 지역 구조물을 위해 주로 이 방법을 개발했습니다.
이 방법을 사용하면 망막에서 AAV의 변환 속도를 정량화할 수 있습니다. 이 방법은 두 방울 PCR의 감도 및 절대 정량화에 의존하며 곧바로 결과를 산출합니다. 디지털 물방울 PCR 방법론의 효율성 때문에 여러 실험실은 이미 정량적 실시간 PCR에서 디지털 물방울 PCR 또는 AAV 티팅으로 전환됩니다.
이 방법은 또한 망막에서 미토콘드리아 DNA 정량화에 대한 기초를 제공할 뿐만 아니라 마우스 망막에서 유전자 치료를 위한 CRISPR 기반 돌연변이 교정의 효율을 확인할 수 있다. 5밀리리터 수요에 AAV 도우미 플라스미드, AAV 캡시드 플라스미드, AAV 벡터 및 PI 용액으로 트랜스페션 혼합물을 준비합니다. 5 밀리리터를 제조한 트랜스페션 혼합물을 배양 매체에 추가합니다.
섭씨 37도에서 감염된 세포를 배양합니다. 48~60시간 후 의 미디어를 수집합니다. DNA로 미디어를 37도에서 30분 동안 밀리리터당 250유닛, 30분간 원심분리기로 30분간 소화합니다.
PBS를 통해 재생된 셀룰로오스 멤브레인을 미리 습식합니다. 0.22 마이크로미터 주사기 필터로 미디어를 100킬로 달톤에 대한 미리 습식 재생셀룰로오스 멤브레인에 넣습니다. 30분 동안 섭씨 4, 000 G에서 재생된 셀룰로오스 멤브레인을 원심분리하고 미디어를 폐기합니다.
PBS로 재생된 셀룰로오스 멤브레인을 세척하고 원심분리하여 30분 동안 섭씨 4000G에서 0.001%의 플루론 F68을 3회 세척한다. 재생된 셀룰로오스 멤브레인의 상부에서 농축 된 AAV를 수집하고 추가 사용을 위해 할당하십시오. 여기서 우리는 작은 규모의 AAV 생산을 만드는 방법을 보여 주었다.
이 프로토콜을 검사한 후 망막에서 기자 의표정을 보기에 충분한 AvV를 만들 수 있어야 합니다. 또한 디지털 PCR의 프로토콜을 따라 생산 된 AAV를 titer할 수 있습니다. 마취 전에 안약이 함유된 0.5%의 열대아미드와 2.5%의 페닐레프린 염산염1방울을 적용하여 동공을 증식합니다.
이소플루란으로 마우스를 마취시키고 반사 신경을 확인합니다. 주입 시술 전에 각 눈에 0.3%의 토브라마이신과 0.1%덱사메타손 멸균 안과 용액 안과 액액을 적용합니다. 수술 후크를 사용하여 눈꺼풀 상부를 안정화시하십시오.
눈의 등대 부분을 노출시키기 위해 약간 뒤로 당깁니다. 후크를 밴드에 테이프로 테이프로 고정합니다. 눈의 clera를 노출하기 위해 곡선 홍채 가위로 결막을 제거합니다.
신선하고 멸균된 30G 인슐린 주사기를 사용하여 clera를 뚫습니다. 마이크로 조작기로 동일한 펑크를 통해 마이크로 주사기의 바늘을 삽입합니다. 바늘 끝을 렌즈 뒤에 두는 눈컵 중간에 놓습니다.
AAV 용액 1리터를 눈의 유리체에 천천히 주입합니다. 바늘을 1분 동안 제자리에 두고 천천히 바늘을 철회하십시오. 안구컵에 0.3%토브라마이신과 0.1%의 덱사메타손이 함유된 항염증제 및 항균 국소 젤 트리트먼트를 적용하십시오.
0.5%의 트로피아미드를 한 방울 떨어뜨리면 됩니다. 그리고 마취 전에 안약이 함유된 2.5%의 페닐레프린 염산염으로 동공을 팽창시. 카르바미드를 그램 국소 젤당 2밀리그램을 눈 표면에 바이런을 발라주세요.
마우스 눈을 중심으로 필요에 따라 마우스 스탠드를 조정합니다. TdTomato 발현을 1주일 및 2주 후에 는 두 눈에 fundus 및 형광 이미징을 수행합니다. 절차 전에 이산화탄소 흡입을 사용하여 동물을 안락사시하십시오.
13.5센티미터 스플리터 포셉의 도움으로 눈공을 앞으로 이동합니다. 렌즈를 남은 유리체와 함께 제거합니다. 정밀 곡선 포셉으로 안구의 연결을 시신경과 잘라내고 동일한 곡선 포셉으로 망막을 부드럽게 짜냅니다.
유전체 DNA를 상용화된 단백질아제 K 다이제스트 필름 기반 조직 게놈 DNA 키트로 분리한다. 단백질Ase K.Lyse 망막으로 30 분 동안 섭씨 55도 200 G에서 망막을 소화하고 제조업체의 프로토콜을 따릅니다. 이러한 프로토콜에서, 우리는 망막과 게놈 DNA 격리뿐만 아니라 intravitreal 주입 fundus 꽃집 화상 진찰을 보여주었습니다.
이들은 망막에 대 한 매우 중요 한 절차, 그리고이 프로토콜을 따라, 생산 된 AAV를 주입 하 고 그들의 식 프로필을 후속 수 있어야 합니다. 그리고 망막 게놈 DNA에서 AAV 게놈을 정량화하여 그 변환 효율을 국자. 여기에서 망막 세포에서 트랜스듀스하는 AAV 게놈의 절대적인 정량화를 할 수 있는 디지털 물방울 PCR의 기본 적용을 볼 수 있습니다.
각 샘플에 대해 마이크로리터 당 1 나노그램의 최종 농도에 도달하기 위해 0.05%의 플루론 F 68 용액으로 주입된 망막으로부터 게놈 DNA를 희석시합니다. 나노그램 게놈 DNA 125 나노몰라 프라이머와 2X 상록 슈퍼 믹스를 포함한 20마이크로리터 PCR 반응 믹스에서 액적 생성을 수행한다. 물방울 생성을 위해 카트리지의 중간 부분에 샘플 믹스를 로드합니다.
그 후 70개의 마이크로리터 액적 생성 오일을 카트리지의 맨 아래 줄에 넣습니다. 개스킷을 카트리지 위에 놓습니다. 개스킷과 카트리지 사이에 간격이 없는지 확인합니다.
그런 다음 액적 생성기에 넣습니다. 상단 종에서 생성되는 약 40 마이크로 리터의 물방울을 부드럽게 가져 가라. 세미 스커트 96-Well PCR 반응 플레이트에 액적 용액을 추가합니다.
알루미늄 밀봉 호일을 사용하여 PCR 플레이트 실러로 PCR 플레이트를 밀봉하십시오. PCR 플레이트를 96-Well 열 밀봉 열 사이클러에 넣습니다. 문서에 표시된 ddPCR 프로토콜을 사용합니다.
데이터를 분석하기 위해 PCR 플레이트를 액적 판독기에 배치합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 기본적인 디지털 PCR 기술을 수행할 수 있어야 합니다. 또한 디지털 PCR 기술에 이상적인 소량의 재료로 가전 된 세포를 사용할 수 있습니다.
그러나 대상 DNA 양을 디지털 방울 PCR의 한계를 초과하지 않도록 신중하게 조정해야 합니다. 실험 절차에 대한 흐름 차트는 다음과 같습니다. 우리는 AAV 티터링 다음에 작은 규모의 AAV 생산을 수행했습니다.
그런 다음 우리는 인트라비티리얼 주사를 수행했습니다. 그 후, 우리는 fundus 형광 화상 진찰에 의해 형광 강도를 정량화했습니다. 그런 다음 마우스 망막을 분리하고 ddPCR에 대한 망막에서 게놈 DNA를 추출했습니다.
Titering AAV는 AAV 변환을 올바르게 정량화할 수 있어야 합니다. ddPCR은 타겟 AAV 제놈을 희석한 액적생성에 따라 달라집니다. 대표적인 ddPCR 결과는 AVV 게놈에 대한 양수 및 음수 액적을 나타낸다.
임계값보다 양수 및 음수는 아래입니다. 희석 인자를 곱한 후, AAV의 티터는 밀리리터 당 게놈 사본에서 10에서 12로 나타났습니다. AAV 대납 효율을 올바르게 정량화하기 위해 여러 망막이 주입되었습니다.
주입된 동물을 이미지화하고, 형광평균 강도가 계산되었다. 2주 시점에서 망막은 고립되었습니다. 및 ddPCR은 WPRE 및 18 S 프라이머를 사용하여 수행되었다.
AAV 주입망막의 형광 강도는 방법론의 힘을 보여주는 AAV 게놈 계산과 상관관계가 있었다. 여기에서, 우리는 몇몇 기술을 보여주었습니다, 소규모 AAV 준비 intravitreal 주입을 포함하여.
