Neste vídeo, mostraremos como quantificar a transdução AAV na retina do rato usando o método PCR de gotícula digital, que é extremamente sensível e faz quantificação absoluta do DNA alvo. Desenvolvemos este método principalmente para grandes construções AVV que não nos permitem usar um gene repórter como construções baseadas em CRISPR. Usando este método, podemos simplesmente quantificar a taxa de transdução de AAVs na retina.
Este método se baseia na sensibilidade e quantificação absoluta do PCR de gotícula digital e produz resultados diretos. Neste vídeo, mostraremos como quantificar a transdução AAV na retina do rato usando o método PCR de gotícula digital, que é extremamente sensível e faz quantificação absoluta do DNA alvo. Desenvolvemos este método principalmente para grandes construções de áreas que não nos permitem usar um gene repórter como construções baseadas em CRISPR.
Usando este método, podemos simplesmente quantificar a taxa de transdução de AAVs na retina. Este método se baseia na sensibilidade e quantificação absoluta das duas gotículas PCR e produz resultados diretos. Devido à eficiência da metodologia de PCR droplet digital, vários laboratórios já mudam de PCR quantitativo em tempo real para pcr de gotícula digital ou titulação AAV.
Este método também pode fornecer uma base para quantificação de DNA mitocondrial na retina, bem como verificar a eficiência da correção de mutação baseada em CRISPR para terapia genética na retina do camundongo. Prepare a mistura de transfecção com plasmídeo de ajudante AAV, plasmídeo de capsídeoS AAV, vetor AAV e solução PI em cinco mililitros de demanda. Adicione os cinco mililitros preparados mistura de transfecção em mídia cultural.
Incubar células transfeinadas a 37 graus celsius. Colete a mídia em 48 a 60 horas após a transfecção. Digerir a mídia com DNAs em uma concentração final de 250 unidades por mililitro por 30 minutos a 37 graus Celsius e uma centrífuga a 4.000 g quatro graus Celsius por 30 minutos.
Pré-molhado a membrana de celulose regenerada com PBS. Filtre a mídia com filtro de seringa de 0,22 micrômetros na membrana de celulose regenerada pré-molhada por 100 quilos Daltons. Centrifugar a membrana de celulose regenerada a 4.000 G quatro graus Celsius por 30 minutos e descartar a mídia.
Lave e centrifufique a membrana de celulose regenerada com PBS contendo F68 plurônico de 0,001% três vezes a 4000 G quatro graus Celsius por 30 minutos. Colete AAVs concentrados da parte superior da membrana de celulose regenerada e aloque para uso posterior. Aqui mostramos como fazer uma produção de AAV de menor escala.
Depois de vetar este protocolo, você deve ser capaz de fazer AVVs que são suficientes para ver a expressão do repórter na retina. Você também pode seguir o protocolo para pcr digital ser capaz de titer os AAVs produzir. Aplique uma gota de 0,5% de tropicamida e 2,5% de cloridrato de fenilefrina contendo colímbia antes da anestesia para dilatar pupilas.
Anestesiar camundongos com isoflurane e verificar os reflexos. Aplique 0,3% de tofilina e 0,1% dexametasona estéril solução oftalmómica para cada olho antes do procedimento de injeção. Use o gancho cirúrgico para estabilizar a pálpebra superior.
Puxe ligeiramente para trás para expor a parte dorsal do olho. Grave o gancho na banda para manter a posição. Remova a conjuntiva com a tesoura de íris curva para expor a esclera do olho.
Use uma seringa de insulina 30G fresca e estéril para perfurar a esclera. Insira a agulha da micro seringa através da mesma punção usando micro manipulador. Coloque a ponta da agulha atrás da lente no meio do copo.
Injete um micro litro de solução AAV lentamente no vítreo do olho. Deixe a agulha no lugar por um minuto e retire lentamente a agulha. Aplique tratamento de gel tópico anti-inflamatório e antibacteriano contendo 0,3% de tobramicina e 0,1% dexametasona no copo ocular.
Aplique uma gota de 0,5% de trópico. E 2,5% cloridrato de fenilefrina contendo colídao antes da anestesia para dilatar pupilas. Aplique carbonamida dois miligramas por grama de gel tópico na superfície dos olhos.
Ajuste o suporte do mouse conforme necessário para centralizar o olho do mouse. Realize imagens de fundus e fluorescência em ambos os olhos para seguir a expressão TdTomato uma semana e duas semanas após a injeção intravitreal. Eutanize os animais usando inalação de dióxido de carbono antes do procedimento.
Mude a bola do olho para a frente com a ajuda de um divisor de 13,5 centímetros. Remova a lente junto com as sobras vítreas. Corte a conexão do globo ocular com o nervo óptico com um fórceps curvos de precisão e aperte suavemente a retina com os mesmos fórceps curvos.
Isole o DNA genômico com um kit de DNA genômico de tecido comercializado K digest. Digerir a retina a 55 graus Celsius 200 G por 30 minutos com retina proteinase K.Lyse completamente e seguir o sprotocol do fabricante. Nestes protocolos, mostramos imagens de cdus florescence de injeção intravitreal, bem como isolamento de retina e DNA genômico.
Estes são procedimentos muito críticos para retina, e seguindo este protocolo, você deve ser capaz de injetar os AAVs produzidos e acompanhar seu perfil de expressão. E concha essa eficiência de transdução quantificando genomas AAV no DNA genômico da retina. Aqui, você pode ver a aplicação básica do PCR de gotícula digital, onde você pode fazer uma quantificação absoluta do genoma AAV que transduem nas células da retina.
Diluir DNAs genômicas de retinas injetadas em solução F 68 plurônica de 0,05% para atingir uma concentração final de um nanograma por microliter para cada amostra. Realize a geração de gotículas em uma mistura de reação PCR de 20 microliters, incluindo um dna genômico nanograma 125 primers nanomolars e 2X evergreen super mix. Carregar a mistura da amostra para a parte média do cartucho para geração de gotículas.
Em seguida, adicione 70 microliters de óleo de geração de gotículas na linha inferior do cartucho. Coloque a junta em cima do cartucho. Certifique-se de que não há diferença entre a junta e o cartucho.
Em seguida, coloque-o no gerador de gotículas. Leve suavemente aproximadamente 40 microliters de gotículas que são geradas no sino superior. Adicione a solução de gotícula à placa de reação PCR 96-Well semi-contornada.
Sele a placa PCR com um selador de placa PCR usando papel alumínio. Coloque a placa PCR no ciclo térmico selado a calor 96-Well. Use o protocolo ddPCR indicado no artigo.
Coloque a placa PCR no leitor de gotículas para analisar os dados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de executar técnica básica de PCR digital. Você também pode usar células exercidas com pequenas quantidades de material, o que é ideal para a técnica digital de PCR.
No entanto, você deve ajustar cuidadosamente a quantidade de DNA alvo para não exceder o limite do PCR de gotícula digital. Aqui está o fluxograma para o procedimento experimental. Realizamos a produção de AAV em pequena escala, que é seguida por AAV titering.
Então realizamos injeção intravitreal. Depois, quantificamos a intensidade fluorescente por imagem de fluorescência fundus. Em seguida, isolou as retinas do rato e extraiu DNA genômico das retinas para ddPCR.
Titering AAV também é fundamental para ser capaz de quantificar corretamente a transdução AAV. ddPCR depende da geração de gotículas que diluíram o genom AAV alvo. Os resultados representativos do DDPCR mostram gotículas positivas e negativas para o genoma AVV.
Positivo acima do limiar e negativo está abaixo. Após a multiplicação com os fatores de diluição, o título de AAVs foi encontrado de 10 a 12 em cópias de genoma por mililitro. Para quantificar corretamente a eficiência de transdução AAV, várias retinas foram injetadas.
Os animais injetados foram imageados, e a intensidade média da fluorescência foi calculada. Em duas semanas, as retinas foram isoladas. E o DDPCR foi realizado utilizando primers WPRE e 18 S.
A intensidade da fluorescência das retinas injetadas AAV foram correlacionadas com os cálculos do genoma AAV, mostrando o poder da metodologia. Aqui, mostramos várias técnicas, incluindo injeção intravitreal de preparação AAV em pequena escala.
