In questo video, mostreremo come quantificare la trasduzione AAV nella retina del topo utilizzando il metodo della PCR a goccia digitale, che è estremamente sensibile e fa la quantificazione assoluta del DNA bersaglio. Abbiamo sviluppato questo metodo principalmente per grandi costrutti AVV che non ci consentono di utilizzare un gene reporter come i costrutti basati su CRISPR. Utilizzando questo metodo, possiamo semplicemente quantificare il tasso di trasduzione degli AAV nella retina.
Questo metodo si basa sulla sensibilità e sulla quantificazione assoluta della PCR a goccia digitale e produce risultati diretti. In questo video, mostreremo come quantificare la trasduzione AAV nella retina del topo utilizzando il metodo della PCR a goccia digitale, che è estremamente sensibile e fa la quantificazione assoluta del DNA bersaglio. Abbiamo sviluppato questo metodo principalmente per costrutti di grandi aree che non ci consentono di utilizzare un gene reporter come i costrutti basati su CRISPR.
Utilizzando questo metodo, possiamo semplicemente quantificare il tasso di trasduzione degli AAV nella retina. Questo metodo si basa sulla sensibilità e sulla quantificazione assoluta della PCR a due goccioline e produce risultati diretti. A causa dell'efficienza della metodologia DIGITAL DROPLET PCR, diversi laboratori passano già dalla PCR quantitativa in tempo reale alla PCR a goccia digitale o alla titolazione AAV.
Questo metodo può anche fornire una base per la quantificazione del DNA mitocondriale nella retina, oltre a verificare l'efficienza della correzione delle mutazioni basata su CRISPR per la terapia genica nella retina del topo. Preparare la miscela di trasfezione con plasmide helper AAV, plasmide capside AAV, vettore AAV e soluzione PI in cinque millilitri richiesti. Aggiungere la miscela di trasfezione preparata per cinque millilitri nei terreni di coltura.
Incubare le cellule trasfettate a 37 gradi Celsius. Raccogli i media a 48-60 ore dopo la trasfezione. Digerire il fluido con DNA ad una concentrazione finale di 250 unità per millilitro per 30 minuti a 37 gradi Celsius e centrifugarlo a 4.000 g quattro gradi Celsius per 30 minuti.
Pre-bagnare la membrana di cellulosa rigenerata con PBS. Filtrare il fluido con un filtro a siringa da 0,22 micrometri nella membrana di cellulosa rigenerata pre-bagnata per 100 chili di Dalton. Centrifugare la membrana di cellulosa rigenerata a 4.000 G a quattro gradi Celsius per 30 minuti e scartare il mezzo.
Lavare e centrifugare la membrana di cellulosa rigenerata con PBS contenente 0,001% Pluronic F68 tre volte a 4000 G quattro gradi Celsius per 30 minuti. Raccogliere AAV concentrati dalla parte superiore della membrana di cellulosa rigenerata e allocarli per un ulteriore utilizzo. Qui abbiamo mostrato come realizzare una produzione AAV su scala ridotta.
Dopo aver esaminato questo protocollo, dovresti essere in grado di creare AVV sufficienti per vedere l'espressione del reporter nella retina. È inoltre possibile seguire il protocollo per la PCR digitale per essere in grado di titer la produzione AAV. Applicare una goccia di 0,5% tropicamide e 2,5% fenilefrina cloridrato contenente collirio prima dell'anestesia per dilatare le pupille.
Anestetizzare i topi con isoflurano e verificare i riflessi. Applicare lo 0,3% di tobramicina e lo 0,1% di desametasone soluzione oftalmica sterile di collirio su ciascun occhio prima della procedura di iniezione. Utilizzare il gancio chirurgico per stabilizzare la palpebra superiore.
Tirare leggermente indietro per esporre la parte dorsale dell'occhio. Fissare il gancio alla fascia per tenerlo in posizione. Rimuovere la congiuntiva con le forbici dell'iride curva per esporre la sclera dell'occhio.
Utilizzare una siringa da insulina da 30 G fresca e sterile per perforare la sclera. Inserire l'ago della micro siringa attraverso la stessa puntura utilizzando il micropolpatore. Posizionare la punta dell'ago dietro la lente al centro della coppa dell'occhio.
Iniettare lentamente un micro litro di soluzione AAV nel vitreo dell'occhio. Lasciare l'ago in posizione per un minuto e ritirare lentamente l'ago. Applicare un trattamento topico in gel antinfiammatorio e antibatterico contenente lo 0,3% di tobramicina e lo 0,1% di desametasone sul padiglione oculare.
Applicare una goccia allo 0,5% di tropicamide. E il 2,5% di fenilefrina cloridrato contenente collirio prima dell'anestesia per dilatare le pupille. Applicare carbamide due milligrammi per grammo di gel topico sulla superficie degli occhi.
Regolare il supporto del mouse in base alle esigenze per centrare l'occhio del mouse. Eseguire l'imaging del fondo e della fluorescenza su entrambi gli occhi per seguire l'espressione di TdTomato una settimana e due settimane dopo l'iniezione intravitreale. Eutanasia degli animali usando l'inalazione di anidride carbonica prima della procedura.
Sposta il bulbo oculare in avanti con l'aiuto di una pinza splitter di 13,5 centimetri. Rimuovere la lente insieme al vitreo rimanente. Tagliare la connessione del bulbo oculare al nervo ottico con una pinza curva di precisione e spremere delicatamente la retina con la stessa pinza curva.
Isolare il DNA genomico con un kit di DNA genomico tissutale basato su film di sintesi della proteinasi K commercializzato. Digerire completamente la retina a 55 gradi Celsius 200 G per 30 minuti con la proteinasi K.Lyse retina e seguire il proprotocolo del produttore. In questi protocolli, abbiamo mostrato l'imaging della florescenza del fondo di iniezione intravitreale, nonché l'isolamento della retina e del DNA genomico.
Queste sono procedure molto critiche per la retina e, seguendo questo protocollo, dovresti essere in grado di iniettare gli AAV prodotti e seguire il loro profilo di espressione. E mestolare l'efficienza di trasduzione quantificando i genomi AAV nel DNA genomico retinico. Qui, puoi vedere l'applicazione di base della PCR a goccioline digitali, dove puoi fare una quantificazione assoluta del genoma AAV che trasduce nelle cellule retiniche.
Diluire i DNA genomici dalle retine iniettate in soluzione F 68 pluronica allo 0,05% per raggiungere una concentrazione finale di un nanogrammo per microlitro per ciascun campione. Esegui la generazione di goccioline in un mix di reazione PCR da 20 microlitri, tra cui un nanogrammo di dna genomico 125 primer nanomolari e 2X evergreen super mix. Caricare la miscela di campioni nella parte centrale della cartuccia per la generazione di goccioline.
Successivamente aggiungere 70 microlitri di olio di generazione di goccioline nella fila inferiore della cartuccia. Mettere la guarnizione sopra la cartuccia. Assicurarsi che non vi sia spazio tra la guarnizione e la cartuccia.
Quindi posizionarlo nel generatore di gocce. Prelevare delicatamente circa 40 microlitri di goccioline che vengono generate nella campana superiore. Aggiungere la soluzione di goccioline alla piastra di reazione PCR semi-gonna a 96 pozzetti.
Sigillare la piastra PCR con un sigillante a piastre PCR utilizzando un foglio di tenuta in alluminio. Posizionare la piastra PCR nel termociclatore termosaldato a 96 pozzetti. Utilizzare il protocollo ddPCR indicato nell'articolo.
Posizionare la piastra PCR nel lettore di gocce per analizzare i dati. Dopo aver guardato questo video, dovresti essere in grado di eseguire la tecnica PCR digitale di base. È inoltre possibile utilizzare celle esercitate con piccole quantità di materiale, ideale per la tecnica PCR digitale.
Tuttavia, è necessario regolare attentamente la quantità di DNA target per non superare il limite della PCR a goccia digitale. Ecco il diagramma di flusso per la procedura sperimentale. Abbiamo eseguito la produzione di AAV su piccola scala, seguita dalla titolazione AAV.
Quindi abbiamo eseguito l'iniezione intravitreale. Successivamente, abbiamo quantificato l'intensità fluorescente mediante l'imaging a fluorescenza del fondo. Quindi isolato le retine di topo ed estratto il DNA genomico dalle retine per la ddPCR.
Anche il titering AAV è fondamentale per essere in grado di quantificare correttamente la trasduzione AAV. ddPCR dipende dalla generazione di goccioline che hanno diluito il genom AAV bersaglio. I risultati rappresentativi della ddPCR mostrano goccioline positive e negative per il genoma AVV.
Positivo sopra la soglia e negativo è sotto. Dopo essersi moltiplicato con i fattori di diluizione, il titolo degli AAV è risultato essere compreso tra 10 e 12 copie del genoma per millilitro. Al fine di quantificare correttamente l'efficienza di trasduzione AAV, sono state iniettate diverse retine.
Gli animali iniettati sono stati ripresi e l'intensità media della fluorescenza è stata calcolata. A due settimane di tempo, le retine sono state isolate. E ddPCR è stato eseguito utilizzando WPRE e primer 18 S.
L'intensità di fluorescenza delle retine iniettate da AAV è stata correlata con i calcoli del genoma AAV, mostrando la potenza della metodologia. Qui, abbiamo mostrato diverse tecniche, tra cui l'iniezione intravitreale di preparazione AAV su piccola scala.
