Bu videoda, son derece hassas olan ve hedef DNA'nın mutlak nicelliğini yapan dijital damlacık PCR yöntemini kullanarak fare retinasında AAV transdüksiyonunun nasıl ölçüleceğini göstereceğiz. Bu yöntemi esas olarak CRISPR tabanlı yapılar gibi bir muhabir geni kullanmamıza izin vermeyen büyük AVV yapıları için geliştirdik. Bu yöntemi kullanarak retinadaki AAV'lerin transdüksiyon oranını basitçe ölçebiliriz.
Bu yöntem, dijital damlacık PCR'nin hassasiyetine ve mutlak nicelemesine dayanır ve doğrudan ileriye doğru sonuçlar verir. Bu videoda, son derece hassas olan ve hedef DNA'nın mutlak nicelliğini yapan dijital damlacık PCR yöntemini kullanarak fare retinasında AAV transdüksiyonunun nasıl ölçüleceğini göstereceğiz. Bu yöntemi esas olarak CRISPR tabanlı yapılar gibi bir muhabir geni kullanmamıza izin vermeyen büyük alan yapıları için geliştirdik.
Bu yöntemi kullanarak retinadaki AAV'lerin transdüksiyon oranını basitçe ölçebiliriz. Bu yöntem, iki damlacık PCR'nin hassasiyetine ve mutlak nicelemesine dayanır ve doğrudan ileriye doğru sonuçlar verir. Dijital damlacık PCR metodolojisinin verimliliği nedeniyle, birkaç laboratuvar zaten nicel gerçek zamanlı PCR'den dijital damlacık PCR veya AAV titrating'e geçer.
Bu yöntem ayrıca retinada mitokondriyal DNA nicelemesi için bir temel oluşturabilir ve fare retinasında gen tedavisi için CRISPR tabanlı mutasyon düzeltmesinin verimliliğini kontrol edebilir. Beş mililitrelik talepte AAV yardımcı plazmid, AAV kapsid plazmid, AAV vektör ve PI çözeltisi ile transfeksiyon karışımı hazırlayın. Hazırlanan beş mililitrelik transfeksiyon karışımını kültür ortamına ekleyin.
Transkröte olmuş hücreleri 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Transfection sonrası 48 ila 60 saat içinde medyayı toplayın. Ortamı mililitre başına 250 birimlik son konsantrasyonda 37 santigrat derecede 30 dakika sindirin ve 30 dakika boyunca 4.000 g dört santigrat derecede bir santrifüjleyin.
Yenilenmiş selüloz zarını PBS ile önceden ıslatın. 100 kilo Daltons için önceden ıslatılmış rejenere selüloz membranına 0,22 mikrometre şırınga filtresi ile ortamı filtreleyin. 4.000 G'de 4.000 G'de yenilenmiş selüloz zarını 30 dakika boyunca santrifüjleyin ve ortamı atın.
Yenilenmiş selüloz membranı PBS ile yıkayın ve santrifüjleyin% 0.001 pluronic F68 30 dakika boyunca 4000 G dört santigrat derecede üç kez. Konsantre AAV'leri rejenere selüloz zarının üst kısmından toplayın ve daha fazla kullanım için tahsis edin. Burada daha küçük ölçekli bir AAV üretiminin nasıl yapılır olduğunu gösterdik.
Bu protokolü inceledikten sonra retinadaki muhabir ifadesini görmek için yeterli olan AVV'leri yapabilmelisiniz. Ayrıca, dijital PCR'nin üretim AAV'lerini titretebilmesi için protokolü de takip edebilirsiniz. Göz bebeklerini genişletmek için anesteziden önce göz damlası içeren %0,5 tropikamid ve %2,5 fenilefrin hidroklorür damlası uygulayın.
Fareleri izofluran ile uyuşturun ve refleksleri doğrulayın. Enjeksiyon işleminden önce her göze %0.3 tobramisin ve %0.1 deksametazon steril oftalmik çözelti göz damlası uygulayın. Üst göz kapağını stabilize etmek için cerrahi kancayı kullanın.
Gözün sırt kısmını açığa çıkarmak için hafifçe geri çekin. Kancayı bantla bantla. Gözün sklerasını ortaya çıkarmak için kavisli iris makası ile konjonktivayı çıkarın.
Sklerayı delmek için taze ve steril bir 30G insülin şırınnası kullanın. Mikro manipülatör kullanarak mikro şırınganın iğnesini aynı delinme yoluyla yerleştirin. İğnenin ucunu lensin arkasına göz kabının ortasına yerleştirin.
Gözün vitreusuna yavaşça bir mikro litre AAV çözeltisi enjekte edin. İğneyi bir dakika yerinde bırakın ve iğneyi yavaşça çekin. Göz kabına %0,3 tobramycin ve %0,1 deksametazon içeren anti-enflamatuar ve anti-bakteriyel topikal jel tedavisi uygulayın.
Bir damla 0.5% tropicamide uygulayın. Ve %2.5 fenilefrin hidroklorür göz bebeklerini genişletmek için anesteziden önce göz damlası içerir. Göz yüzeyine gram topikal jel başına iki miligram karbamid uygulayın.
Fare gözünü ortalamak için fare standını gerektiği gibi ayarlayın. İntravitreal enjeksiyondan bir hafta ve iki hafta sonra TdTomato ekspresyonuna uymak için her iki gözde fundus ve floresan görüntüleme gerçekleştirin. İşlemden önce karbondioksit soluma kullanarak hayvanları ötenazi.
Göz toplarını 13,5 santimetrelik ayırıcı forseps yardımıyla ileri kaydırın. Lensi arta kalan vitreus ile birlikte çıkarın. Göz küresinin optik sinire olan bağlantısını hassas kavisli bir önps ile kesin ve retinayı aynı kavisli tokalarla hafifçe sıkın.
Genomik DNA'yı ticarileştirilmiş proteinaz K sindirme filmi tabanlı doku genomik DNA kiti ile izole edin. 55 santigrat derece 200 G'de retinayı proteinaz K.Lyse retina ile 30 dakika boyunca tamamen sindirin ve üreticinin sprotokol'ını takip edin. Bu protokollerde intravitreal enjeksiyon fundus florescence görüntülemenin yanı sıra retina ve genomik DNA izolasyonu gösterdik.
Bunlar retina için çok kritik prosedürlerdir ve bu protokole uyarak, üretilen AAV'leri enjekte edebilmeli ve ifade profillerini takip edebilmelisiniz. Ve retina genomik DNA'sında AAV genomlarını ölçerek bu transdüksiyon verimliliğini kepçele. Burada, retina hücrelerinde transdüse olan AAV genomunun mutlak bir nicelliğini gerçekleştirebileceğiniz dijital damlacık PCR'nin temel uygulamasını görebilirsiniz.
Enjekte edilen retinalardan genomik DNA'ları %0,05 pluronic F 68 çözeltisinde seyrelterek her örnek için mikroliter başına bir nanogramlık nihai konsantrasyona ulaşın. Bir nanogram genomik DNA 125 nanomolar astar ve 2X yaprak dökmeyen süper karışım dahil olmak üzere 20 mikrolitre PCR reaksiyon karışımında damlacık üretimi gerçekleştirin. Damlacık üretimi için numune karışımını kartuşun orta kısmına yükleyin.
Daha sonra kartuşun alt sırasına 70 mikrolitre damlacık üretim yağı ekleyin. Contayı kartuşun üstüne koyun. Conta ile kartuş arasında boşluk olmadığından emin olun.
Sonra damlacık jeneratörüne yerleştirin. Üst zilde oluşturulan yaklaşık 40 mikrolitre damlacıkları hafifçe alın. Yarı etekli 96-Well PCR reaksiyon plakasına damlacık çözeltisi ekleyin.
Alüminyum sızdırmazlık folyosu kullanarak PCR plakasını bir PCR plaka sızdırmazlıklayıcı ile kapatın. PCR plakasını 96 Kuyulu ısı sızdırmaz termal çevrime yerleştirin. Makalede belirtilen ddPCR protokolünü kullanın.
Verileri analiz etmek için PCR plakasını damlacık okuyucuya yerleştirin. Bu videoyu izledikten sonra temel dijital PCR tekniğini gerçekleştirebilmelisiniz. Ayrıca, dijital PCR tekniği için ideal olan küçük miktarda malzemeye sahip eforlu hücreleri de kullanabilirsiniz.
Ancak, hedef DNA miktarını dijital damlacık PCR sınırını aşmayacak şekilde dikkatlice ayarlamalısınız. İşte deneysel prosedürün akış şeması. Küçük ölçekli AAV üretimi gerçekleştirdik, bunu AAV titering takip ediyor.
Sonra intravitreal enjeksiyon yaptık. Daha sonra, floresan yoğunluğunu fundus floresan görüntüleme ile ölçtük. Daha sonra fare retinalarını izole etti ve ddPCR için retinalardan genomik DNA çıkardı.
Titering AAV, AAV transdüksiyonun doğru bir şekilde ölçülebilmesi için de kritik öneme sahiptir. ddPCR, hedef AAV genomunun seyreltilmiş damlacıkların üretimine bağlıdır. Temsili ddPCR sonuçları AVV genom için pozitif ve negatif damlacıklar göstermektedir.
Eşiğin üzerinde pozitif ve negatif aşağıdadır. Seyreltme faktörleri ile çoğaldıktan sonra, AAV'lerin titresinin mililitre başına genom kopyalarında 10 ila 12 olduğu bulunmuştur. AAV tranduction verimliliğini doğru bir şekilde ölçmek için birkaç retina enjekte edildi.
Enjekte edilen hayvanlar görüntülendi ve floresan ortalama yoğunluğu hesaplandı. İki haftalık zaman noktasında retinalar izole edildi. Ve ddPCR WPRE ve 18 S astarlar kullanılarak gerçekleştirildi.
AAV enjekte edilen retinaların floresan yoğunluğu, metodolojinin gücünü gösteren AAV genom hesaplamaları ile ilişkiliydi. Burada, küçük ölçekli AAV hazırlama intravitreal enjeksiyonu da dahil olmak üzere çeşitli teknikler gösterdik.
