تقنية ELISA مفيدة حقا للكشف عن طفيلي الملاريا في البعوض الناقل بحساسية عالية وخصوصية ، وقادرة على معالجة الكثير من العينات في نفس الوقت. تسمح هذه التقنية للباحثين بالاحتفاظ بعينات البعوض حتى تصبح جاهزة لمعالجة العينات ، ويمكن إجراؤها للتمييز بين أنواع البلازموديوم باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الخاصة بالأنواع. قم بإعداد العينة عن طريق فصل رأس وصدر البعوض عن البطن ، ووضعها في أنبوب طحن بالطرد المركزي سعة 1.5 ملليلتر محدد مسبقا.
أضف 50 ميكرولترا من محلول الطحن إلى كل أنبوب ، وقم بتجانس العينة مع مدقة. شطف المدقة مع 250 ميكرولتر من العازلة طحن ، وإضافة الحل إلى الأنبوب لجعل الحجم النهائي يصل إلى 300 ميكرولتر. قم بإعداد لوحة ELISA لبروتين circumsporozoite ، واملأ ورقة عمل sporozoite ELISA.
تحضير محلول الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني ، وإضافة خمسة ملليلتر من الحل لكل لوحة. ماصة 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة في كل بئر من لوحة ELISA. ضع غطاء على الطبق ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة أو طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
استنشاق المحلول في البئر ، واضغط على اللوحة على منشفة ورقية خمس مرات لإزالة السائل. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب في ألواح البئر ، وقم بتغطيتها بغطاء. احتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، واستنشاق محتوى البئر.
اضغط مرة أخرى على اللوحة على منشفة ورقية لإزالة السائل. أضف 50 ميكرولترا من التحكم الإيجابي إلى بئري H و H. ثم أضف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للانسداد في الآبار في العمودين الأول والثاني من الصفوف C إلى G.أضف 50 ميكرولترا من التحكم الإيجابي في البئرين G one و G.
قم بتخفيف التحكم الإيجابي بشكل متسلسل بدءا من G واحد و G اثنين ، متبوعا ب F واحد و F اثنان حتى C واحد و C اثنان. أضف 50 ميكرولترا من عنصر التحكم السلبي إلى الآبار A واحد و A اثنان و B واحد و B اثنان. استخراج 50 ميكرولتر من محلول متجانسة ، وإضافته إلى بئر غير معروف.
غطي الطبق واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. تحضير محلول الركيزة عن طريق خلط الركيزة A و B بنسبة واحد إلى واحد. حدد الحجم المطلوب بناء على إضافة خمسة ملليلتر من محلول الأجسام المضادة المترافق العامل إلى كل لوحة.
أوجد نشاط البيروكسيديز بإضافة خمسة ميكرولترات من محلول الجسم المضاد المسمى بالبيروكسيديز إلى 100 ميكرولتر من محلول الركيزة في أنبوب حجمه 1.5 ملليلتر. استنشاق محتوى البئر ، وإزالة السائل عن طريق وضع اللوحة رأسا على عقب على منشفة ورقية. اغسل الآبار مرتين ب 200 ميكرولتر من PBS Tween.
استنشق محتويات البئر ، واضغط على اللوحة خمس مرات. أضف 50 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة المسمى بيروكسيديز إلى كل بئر. ثم احتضان في الظلام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
نضح محتوى البئر ، واضغط على اللوحة على منشفة ورقية خمس مرات. اغسل الآبار ب 200 ميكرولتر من PBS Tween ثلاث مرات ، واستنشق المحتويات ، واضغط على اللوحة خمس مرات. أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة إلى كل بئر.
غطي الطبق واحتضانه في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اقرأ الامتصاص عند 405 إلى 414 نانومتر باستخدام قارئ لوحة ELISA. قم بتسمية العينات التي تحتوي على امتصاص بقيمة أعلى من الحد الفاصل على أنها موجبة ، وحدد تركيز CSP في العينة باستخدام المعيار.
ارسم قيم الامتصاص مقابل تركيز المحلول لتوليد منحنى قياسي. حدد أفضل ملاءمة باستخدام طريقة الانحدار الخطي. حل معادلة كل قيمة امتصاص لعينة موجبة لتحديد تركيز الطاقة الشمسية المركزة (CSP).
بعد 30 دقيقة من إجراء ELISA مع ABTS ، يمكن اكتشاف عدوى sporozoite من خلال ظهور لون أخضر باهت في البئر. لم يظهر التحكم الإيجابي أي تغيير في اللون في البئر. تم تحديد قيم الامتصاص للآبار السالبة والموجبة.
أظهر البئر الموجب قيمة امتصاص أعلى من عتبة القطع ، بينما أظهرت الضوابط السلبية قيما أقل بكثير. علاوة على ذلك ، تم الحصول أيضا على قيم امتصاص 80 بئرا أخرى غير معروفة. يمثل الخط المتصل متوسط امتصاص آبار التحكم السلبية ، ويمثل الخط المتقطع عتبة الإيجابية.
باستخدام المنحنى القياسي ، تم تحديد تركيز CSP في البئر A سبعة ليكون 0.35 بيكوجرام لكل ميكرولتر يجب تنفيذ هذه الخطوة من معالجة ELISA بسرعة لمنع المتجهات غير المحددة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب حفظ جميع العينات والمحلول في الثلاجة لمنع نمو الميكروبات. ينصح الباحثون بتأكيد الاكتشافات الإيجابية بطرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل.
سيؤدي ذلك إلى تحسين الثقة بشكل كبير ، خاصة عندما يتم تقييم القراءة الوحيدة فوق العتبة. وقد سمحت هذه التقنية للباحثين بإجراء مسوحات واسعة النطاق للعدوى المحتملة في البعوض ، وهو أمر مهم لتحديد الناقل الرئيسي.
