La technique ELISA est vraiment utile pour détecter le parasite du paludisme chez le moustique vecteur avec une sensibilité et une spécificité élevées, et capable de traiter beaucoup d’échantillons en même temps. Cette technique permet aux chercheurs de conserver des échantillons de moustiques jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour le traitement des échantillons, et elle peut être réalisée pour différencier les espèces de Plasmodium à l’aide d’anticorps monoclonaux spécifiques à l’espèce. Préparez l’échantillon en séparant la tête et le thorax des moustiques de l’abdomen, et placez-les dans un tube de broyage de centrifugeuse de 1,5 millilitre pré-étiqueté.
Ajoutez 50 microlitres de tampon de broyage dans chaque tube et homogénéisez l’échantillon à l’aide d’un pilon. Rincez le pilon avec 250 microlitres de tampon de broyage et ajoutez la solution dans le tube pour porter le volume final à 300 microlitres. Préparez une plaque ELISA pour la protéine circumsporozoïte et remplissez la feuille de travail ELISA pour les sporozoïtes.
Préparez la solution d’anticorps dans du PBS et ajoutez cinq millilitres de solution par plaque. Pipeter 50 microlitres de la solution d’anticorps dans chaque puits de la plaque ELISA. Placez un couvercle sur l’assiette et laissez incuber pendant 30 minutes ou toute la nuit à température ambiante.
Aspirez la solution dans le puits et tapotez cinq fois l’assiette sur une serviette en papier pour retirer le liquide. Ajoutez 200 microlitres de tampon de blocage dans les plaques de puits et couvrez avec un couvercle. Incuber pendant une heure à température ambiante et aspirer le bien contenu.
Tapotez à nouveau l’assiette sur une serviette en papier pour retirer le liquide. Ajouter 50 microlitres de contrôle positif aux puits H un et H deux. Ajoutez ensuite 50 microlitres de tampon de blocage dans les puits des colonnes un et deux des rangées C à G.Ajoutez 50 microlitres de contrôle positif dans les puits G un et G deux.
Diluez en série le témoin positif en commençant par G un et G deux, suivi de F un et F deux jusqu’à C un et C deux. Ajoutez 50 microlitres du témoin négatif aux puits A un, A deux, B un et B deux. Extrayez 50 microlitres de la solution d’homogénat et ajoutez-la dans un puits inconnu.
Couvrez l’assiette et incubez-la à température ambiante pendant deux heures. Préparez la solution de substrat en mélangeant les substrats A et B dans un rapport de un à un. Déterminez le volume requis en ajoutant cinq millilitres de solution d’anticorps conjugués de travail dans chaque plaque.
Évaluez l’activité de la peroxydase en ajoutant cinq microlitres de la solution d’anticorps marqués à la peroxydase à 100 microlitres de la solution de substrat dans un tube de 1,5 millilitre. Aspirez le bien contenu et retirez le liquide en mettant l’assiette à l’envers sur une serviette en papier. Lavez les puits deux fois avec 200 microlitres de PBS Tween.
Aspirez le contenu du puits et tapotez la plaque cinq fois. Ajouter 50 microlitres de solution d’anticorps marqués à la peroxydase dans chaque puits. Ensuite, incubez dans l’obscurité pendant une heure à température ambiante.
Aspirez le contenu du puits et tapotez cinq fois l’assiette sur une serviette en papier. Lavez les puits avec 200 microlitres de PBS Tween trois fois, aspirez le contenu et tapotez la plaque cinq fois. Ajoutez 100 microlitres de solution de substrat dans chaque puits.
Couvrez l’assiette et laissez incuber dans l’obscurité pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, lire l’absorbance à 405 à 414 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaque ELISA. Étiqueter les échantillons ayant une absorbance dont la valeur est supérieure au seuil comme étant positif et déterminer la concentration de CSP dans l’échantillon à l’aide de l’étalon.
Tracez les valeurs d’absorbance en fonction de la concentration de la solution pour générer une courbe standard. Déterminez le meilleur ajustement à l’aide de la méthode de régression linéaire. Résolvez l’équation de chaque valeur d’absorbance d’un échantillon positif pour déterminer la concentration de CSP.
Après 30 minutes d’exécution d’un test ELISA avec ABTS, l’infection par le sporozoïte a pu être détectée par l’apparition d’une légère couleur verte dans le puits. Le témoin positif n’a montré aucun changement de couleur dans le puits. Les valeurs d’absorbance pour les puits négatifs et positifs ont été déterminées.
Le puits positif présentait une valeur d’absorbance supérieure au seuil de seuil, tandis que les témoins négatifs présentaient des valeurs significativement plus faibles. De plus, les valeurs d’absorbance des 80 autres puits inconnus ont également été obtenues. La ligne continue représente l’absorbance moyenne des puits de contrôle négatifs, et la ligne pointillée représente le seuil de positivité.
À l’aide de la courbe standard, la concentration de CSP dans le puits A sept a été déterminée à 0,35 picogramme par microlitre. Cette étape du traitement ELISA doit être effectuée rapidement pour éviter les vecteurs non spécifiques. De plus, tous les échantillons et la solution doivent être conservés au réfrigérateur pour éviter la croissance microbienne. Il est recommandé aux chercheurs de confirmer les détections positives par d’autres méthodes telles que la PCR.
Cela améliorera considérablement la confiance, surtout lorsque la seule lecture est évaluée au-dessus du seuil. Cette technique a permis aux chercheurs de mener des enquêtes à plus grande échelle sur une éventuelle infection chez les moustiques, ce qui est important pour identifier le principal vecteur.
