ELISA tekniği, sivrisinek vektöründeki sıtma parazitini yüksek hassasiyet ve özgüllükle tespit etmek ve aynı anda çok sayıda numuneyi işleyebilmek için gerçekten yararlıdır. Bu teknik, araştırmacıların sivrisinek örneklerini örnek işleme için hazır olana kadar tutmalarına olanak tanır ve türe özgü monoklonal antikorlar kullanılarak Plasmodium türlerini ayırt etmek için gerçekleştirilebilir. Sivrisineklerin başını ve göğüs kafesini karından ayırarak numuneyi hazırlayın ve önceden etiketlenmiş 1.5 mililitrelik bir santrifüj öğütme tüpüne yerleştirin.
Her tüpe 50 mikrolitre öğütme tamponu ekleyin ve numuneyi bir havaneli ile homojenize edin. Havaneli 250 mikrolitre öğütme tamponu ile durulayın ve son hacmi 300 mikrolitreye çıkarmak için çözeltiyi tüpe ekleyin. Circumsporozoite proteini için bir ELISA plakası hazırlayın ve sporozoit ELISA çalışma sayfasını doldurun.
Antikor çözeltisini PBS'de hazırlayın ve plaka başına beş mililitre çözelti ekleyin. ELISA plakasının her bir oyuğuna 50 mikrolitre antikor solüsyonu pipetleyin. Tabağa bir kapak yerleştirin ve 30 dakika veya gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
Çözeltiyi kuyuya aspire edin ve sıvıyı çıkarmak için plakayı bir kağıt havluya beş kez vurun. Kuyu plakalarına 200 mikrolitre engelleme tamponu ekleyin ve bir kapakla kapatın. Oda sıcaklığında bir saat inkübe edin ve kuyu içeriğini aspire edin.
Sıvıyı çıkarmak için plakayı tekrar bir kağıt havluya vurun. H bir ve H iki kuyucuğuna 50 mikrolitre pozitif kontrol ekleyin. Daha sonra C'den G'ye kadar olan sıraların birinci ve ikinci sütunlarındaki kuyucuklara 50 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin.
Pozitif kontrolü G bir ve G iki'den başlayarak, ardından F bir ve F iki'yi C bir ve C ikiye kadar seri olarak seyreltin. A bir, A iki, B bir ve B iki kuyularına 50 mikrolitre negatif kontrol ekleyin. Homojenat çözeltisinden 50 mikrolitre çıkarın ve bilinmeyen bir kuyuya ekleyin.
Plakayı örtün ve iki saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Substrat A ve B'yi bire bir oranında karıştırarak substrat çözeltisini hazırlayın. Her plakaya beş mililitre çalışma eşlenik antikor çözeltisi eklemeye dayalı olarak gerekli hacmi belirleyin.
1.5 mililitrelik bir tüpte 100 mikrolitre substrat çözeltisine beş mikrolitre peroksidaz etiketli antikor çözeltisi ekleyerek peroksidaz aktivitesini değerlendirin. Kuyu içeriğini aspire edin ve plakayı bir kağıt havlu üzerine baş aşağı koyarak sıvıyı çıkarın. Kuyuları 200 mikrolitre PBS Tween ile iki kez yıkayın.
Kuyu içeriğini aspire edin ve plakaya beş kez vurun. Her oyuğa 50 mikrolitre peroksidaz etiketli antikor çözeltisi ekleyin. Daha sonra karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.
Kuyu içeriğini aspire edin ve plakayı bir kağıt havluya beş kez vurun. Kuyuları 200 mikrolitre PBS Tween ile üç kez yıkayın, içindekileri aspire edin ve plakaya beş kez vurun. Her kuyucuğa 100 mikrolitre substrat çözeltisi ekleyin.
Plakayı örtün ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bir ELISA plaka okuyucu kullanarak 405 ila 414 nanometredeki absorbansı okuyun. Absorbansa sahip numuneleri, kesme değerinin üzerinde bir değere sahip olarak pozitif olarak etiketleyin ve standardı kullanarak numunedeki CSP konsantrasyonunu belirleyin.
Standart bir eğri oluşturmak için absorbans değerlerini çözelti konsantrasyonuna karşı çizin. Doğrusal regresyon yöntemini kullanarak en uygun olanı belirleyin. CSP konsantrasyonunu belirlemek için pozitif bir numune için her bir absorbans değerinin denklemini çözün.
ABTS ile ELISA uygulandıktan 30 dakika sonra, sporozoit enfeksiyonu kuyuda soluk yeşil bir rengin ortaya çıkmasıyla tespit edilebilir. Pozitif kontrol kuyuda herhangi bir renk değişikliği göstermedi. Negatif ve pozitif kuyular için absorbans değerleri belirlenmiştir.
Pozitif kuyu, kesme eşiğinin üzerinde bir absorbans değeri sergilerken, negatif kontroller önemli ölçüde daha düşük değerler gösterdi. Ayrıca, diğer 80 bilinmeyen kuyunun absorbans değerleri de elde edilmiştir. Düz çizgi, negatif kontrol kuyularının ortalama absorbansını temsil eder ve kesikli çizgi, pozitiflik eşiğini temsil eder.
Standart eğri kullanılarak, A yedi kuyusundaki CSP konsantrasyonunun mikrolitre başına 0.35 pikogram olduğu belirlendi ELISA işleminin bu adımı, spesifik olmayan vektörü önlemek için hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Ek olarak, mikrobiyal büyümeyi önlemek için tüm numuneler ve çözelti buzdolabında saklanmalıdır. Araştırmacıların pozitif tespitleri PCR gibi diğer yöntemlerle doğrulamaları önerilir.
Bu, özellikle tek okuma eşiğin üzerinde değerlendiğinde, güveni önemli ölçüde artıracaktır. Bu teknik, araştırmacıların sivrisineklerde olası enfeksiyon araştırmaları yapmalarına izin verdi ve bu da ana vektörü tanımlamak için önemlidir.
