טכניקת ELISA שימושית מאוד לאיתור טפיל מלריה בווקטור היתוש עם רגישות גבוהה וספציפיות, ומסוגלת לעבד הרבה דגימה בו זמנית. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לשמור דגימות יתושים עד שהן מוכנות לעיבוד דגימות, וניתן לבצע אותה כדי להבדיל מיני פלסמודיום באמצעות נוגדנים חד-שבטיים ספציפיים למין. הכינו את הדגימה על ידי הפרדת הראש ובית החזה של היתושים מהבטן, והניחו אותם בצינור טחינת צנטריפוגות 1.5 מיליליטר שכותרתו מראש.
מוסיפים 50 מיקרוליטר של חיץ טחינה לכל צינור, והומוגניים את הדגימה עם מזיק. שוטפים את המזיק עם 250 מיקרוליטר של חיץ השחזה, ומוסיפים את התמיסה לצינור כדי להביא את הנפח הסופי עד 300 מיקרוליטר. הכינו צלחת ELISA לחלבון circumsporozoite ומלאו את דף העבודה sporozoite ELISA.
הכינו את תמיסת הנוגדנים ב- PBS, והוסיפו חמישה מיליליטר של התמיסה לצלחת. פיפטה 50 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים לתוך כל באר של צלחת ELISA. מניחים מכסה על הצלחת, ודגרים במשך 30 דקות או לילה בטמפרטורת החדר.
שאפו את התמיסה בבאר, והקישו על הצלחת על מגבת נייר חמש פעמים כדי להסיר את הנוזל. מוסיפים 200 מיקרוליטר של חיץ חוסם בצלחות הבאר, ומכסים במכסה. דוגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר, ושואפים את תכולת הבאר.
שוב הקש על הצלחת על מגבת נייר כדי להסיר את הנוזל. הוסף 50 מיקרוליטר של שליטה חיובית לבארות H אחת ו- H שתיים. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של חיץ חוסם לתוך הבארות בעמודות אחת ושתיים של שורות C עד G.הוסף 50 מיקרוליטר של הבקרה החיובית לתוך G אחד ו- G שתי בארות.
מדללים באופן סדרתי את השליטה החיובית החל מ-G אחת ו-G שתיים, ואחריה F אחת ו-F שתיים עד C אחת ו-C שתיים. הוסף 50 מיקרוליטר של הבקרה השלילית לבארות A אחת, A שתיים, B אחת ו- B שתיים. לחלץ 50 מיקרוליטר של הפתרון homogenate, ולהוסיף אותו לבאר לא ידוע.
מכסים את הצלחת ודגרים עליה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. הכינו את תמיסת המצע על ידי ערבוב מצע A ו-B ביחס של אחד לאחד. קבע את הנפח הנדרש על סמך הוספת חמישה מיליליטר של תמיסת נוגדנים מצומדת לכל צלחת.
להעריך את פעילות peroxidase על ידי הוספת חמישה מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים peroxidase שכותרתו 100 מיקרוליטר של תמיסת המצע בצינור 1.5 מיליליטר. שואפים את תכולת הבאר, ומוציאים את הנוזל על ידי הנחת הצלחת הפוכה על מגבת נייר. לשטוף את הבארות פעמיים עם 200 מיקרוליטר של PBS Tween.
שאפו את תכולת הבאר, והקישו על הצלחת חמש פעמים. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים המסומנת peroxidase לכל באר. לאחר מכן דוגרים בחושך למשך שעה בטמפרטורת החדר.
שאפו את תכולת הבאר, והקישו על הצלחת על מגבת נייר חמש פעמים. שטפו את הבארות עם 200 מיקרוליטר של PBS Tween שלוש פעמים, שאפו את התוכן והקישו על הצלחת חמש פעמים. מוסיפים 100 מיקרוליטר של תמיסת המצע לכל באר.
מכסים את הצלחת ודגרים בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, קרא את הספיגה ב 405 עד 414 ננומטר באמצעות קורא לוחות ELISA. תייג את הדגימות בעלות ספיגה עם ערך מעל הסף כחיוביות, וקבע את ריכוז CSP בדגימה באמצעות התקן.
התווה את ערכי הספיגה לעומת ריכוז התמיסה כדי ליצור עקומה סטנדרטית. קבע את ההתאמה הטובה ביותר באמצעות שיטת רגרסיה ליניארית. פתור את המשוואה של כל ערך ספיגה עבור דגימה חיובית כדי לקבוע את ריכוז CSP.
לאחר 30 דקות של ביצוע ELISA עם ABTS, זיהום sporozoite יכול להיות מזוהה על ידי הופעת צבע ירוק קלוש בבאר. הבקרה החיובית לא הראתה שינוי צבע בבאר. נקבעו ערכי הספיגה של הבארות השליליות והחיוביות.
הבאר החיובית הציגה ערך ספיגה שהיה מעל סף הסף, בעוד שהבקרות השליליות הציגו ערכים נמוכים משמעותית. כמו כן, התקבלו ערכי ספיגה של 80 בארות לא ידועות אחרות. הקו המוצק מייצג את הספיגה הממוצעת של בארות הבקרה השליליות, והקו המקווקו מייצג את סף החיוביות.
באמצעות העקומה הסטנדרטית, ריכוז CSP בבאר A שבע נקבע להיות 0.35 פיקוגרם למיקרוליטר שלב זה של עיבוד ELISA צריך להתבצע במהירות כדי למנוע וקטור לא ספציפי. בנוסף, כל הדגימות ואת הפתרון צריך להישמר במקרר כדי למנוע את הצמיחה המיקרוביאלית. מומלץ לחוקרים לאשר את הגילויים החיוביים בשיטות אחרות כגון PCR.
זה ישפר משמעותית את הביטחון, במיוחד כאשר הקריאה היחידה מוערכת מעל הסף. טכניקה זו אפשרה לחוקרים לערוך סקרים בקנה מידה גדול יותר של זיהום אפשרי ביתושים, אשר חשוב לזיהוי הווקטור הראשי.
