La técnica ELISA es realmente útil para detectar el parásito de la malaria en el mosquito vector con alta sensibilidad y especificidad, y capaz de procesar mucha muestra al mismo tiempo. Esta técnica permite a los investigadores conservar muestras de mosquitos hasta que estén listas para el procesamiento de muestras, y se puede realizar para diferenciar especies de Plasmodium utilizando anticuerpos monoclonales específicos de la especie. Prepare la muestra separando la cabeza y el tórax de los mosquitos del abdomen, y colóquelos en un tubo de molienda de centrífuga de 1,5 mililitros preetiquetado.
Añadir 50 microlitros de tampón de molienda a cada tubo, y homogeneizar la muestra con un mortero. Enjuague el mortero con 250 microlitros de tampón de molienda y agregue la solución al tubo para aumentar el volumen final a 300 microlitros. Prepare una placa ELISA para la proteína circumsporozoíto y complete la hoja de trabajo ELISA del esporozoíto.
Prepare la solución de anticuerpos en PBS y agregue cinco mililitros de la solución por placa. Pipetee 50 microlitros de la solución de anticuerpos en cada pocillo de la placa ELISA. Coloque una tapa en el plato e incube durante 30 minutos o toda la noche a temperatura ambiente.
Aspire la solución en el pocillo y golpee el plato con una toalla de papel cinco veces para eliminar el líquido. Agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo en las placas de pocillos y cubra con una tapa. Incubar durante una hora a temperatura ambiente y aspirar el contenido del pocillo.
Nuevamente, golpee el plato sobre una toalla de papel para eliminar el líquido. Agregue 50 microlitros de control positivo a los pocillos H uno y H dos. Luego agregue 50 microlitros de tampón de bloqueo en los pocillos de las columnas uno y dos de las filas C a G. Agregue 50 microlitros del control positivo en los pocillos G uno y G dos.
Diluir en serie el control positivo a partir de G uno y G dos, seguido de F uno y F dos hasta C uno y C dos. Agregue 50 microlitros del control negativo a los pocillos A uno, A dos, B uno y B dos. Extraiga 50 microlitros de la solución homogeneizada y agréguela a un pozo desconocido.
Cubra la placa e incube a temperatura ambiente durante dos horas. Prepare la solución de sustrato mezclando el sustrato A y B en una proporción de uno a uno. Determine el volumen requerido en función de la adición de cinco mililitros de solución de anticuerpos conjugados de trabajo a cada placa.
Evalúe la actividad de la peroxidasa añadiendo cinco microlitros de la solución de anticuerpos marcados con peroxidasa a 100 microlitros de la solución de sustrato en un tubo de 1,5 mililitros. Aspire el contenido del pocillo y retire el líquido colocando el plato boca abajo sobre una toalla de papel. Lave los pocillos dos veces con 200 microlitros de PBS Tween.
Aspire el contenido del pocillo y golpee la placa cinco veces. Agregue 50 microlitros de solución de anticuerpos marcados con peroxidasa a cada pocillo. Luego incube en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente.
Aspire el contenido del pozo y golpee el plato con una toalla de papel cinco veces. Lave los pocillos con 200 microlitros de PBS Tween tres veces, aspire el contenido y golpee la placa cinco veces. Agregue 100 microlitros de la solución de sustrato a cada pocillo.
Cubra el plato e incube en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, lea la absorbancia a 405 a 414 nanómetros utilizando un lector de placas ELISA. Etiquete las muestras que tienen absorbancia con un valor por encima del punto de corte como positivas y determine la concentración de CSP en la muestra utilizando el estándar.
Represente los valores de absorbancia frente a la concentración de la solución para generar una curva estándar. Determine el mejor ajuste utilizando el método de regresión lineal. Resuelva la ecuación de cada valor de absorbancia para una muestra positiva para determinar la concentración de CSP.
Después de 30 minutos de realizar ELISA con ABTS, la infección por esporozoíto pudo detectarse por la aparición de un tenue color verde en el pocillo. El testigo positivo no mostró ningún cambio de color en el pocillo. Se determinaron los valores de absorbancia para los pozos negativo y positivo.
El pozo positivo exhibió un valor de absorbancia que estuvo por encima del umbral de corte, mientras que los controles negativos mostraron valores significativamente más bajos. Además, se obtuvieron los valores de absorbancia de los otros 80 pozos desconocidos. La línea continua representa la absorbancia media de los pozos de control negativos, y la línea discontinua representa el umbral de positividad.
Utilizando la curva estándar, se determinó que la concentración de CSP en el pozo A siete era de 0,35 picogramos por microlitro. Este paso del procesamiento de ELISA debe realizarse rápidamente para evitar vectores inespecíficos. Además, todas las muestras y la solución deben guardarse en el refrigerador para evitar el crecimiento microbiano. Se recomienda a los investigadores confirmar las detecciones positivas por otros métodos, como la PCR.
Esto mejorará significativamente la confianza, especialmente cuando la única lectura se valora por encima del umbral. Esta técnica ha permitido a los investigadores realizar estudios a mayor escala de la posible infección en los mosquitos, lo cual es importante para identificar el vector principal.
