该协议意义重大，因为它使用光遗传学技术的新进展和药物滥用的临床前模型来逆转负责促进复发的神经回路中的可塑性。该技术的主要优点是它允许对清醒动物的突触活动进行回路特异性操作，这对未来线索动机的可卡因寻求行为具有持久的抑制作用。这种方法可以在许多其他系统和电路中使用，以专门操纵行为相关的神经可塑性。
通过将 26 号不锈钢注射套管连接到装有一微升浓缩 AAV 溶液的汉密尔顿注射器开始准备手术。麻醉动物后，如文本手稿中所述，剃除手术区域并润滑眼睛以防止干燥。接下来，通过上背部皮肤皮下注射体重体积的镇痛药卡洛芬，并通过下背部皮肤皮下注射五毫升乳酸林格氏溶液。
然后进行静脉导管植入。导管植入后，立即将大鼠固定在立体定位框架中以进行腺相关病毒注射。通过颅骨上方的皮肤皮下注射利多卡因，以局部麻醉该区域，然后从颅骨的前部到后部做一个0.5毫米的切口。
去除覆盖的组织以露出颅骨表面。将大鼠的头部沿前后轴和零立体定位坐标调平到前膛，然后使用配备有小钻头的dremel工具在头骨上钻三个小孔，并用螺丝刀将不锈钢螺钉安装到位。对于AAV的注射，根据大鼠脑图谱的坐标钻双侧孔“用于内侧膝状核或MGN。
相对于前后轴使用的坐标为后轴负 5.4 毫米，内侧轴加 3 毫米，背腹轴负 6.6 毫米。以每分钟约4毫米的速度缓慢降低注射套管，直到套管正确定位在MGN中，并以每分钟0.1微升的速度注射浓缩的AAV溶液。输注完成后，将注射套管留在原位五分钟，以使病毒从套管中扩散出去，然后慢慢从大脑中取出套管。
接下来，继续植入针对内侧膝状核侧杏仁核末端的光纤。使用dremel工具在侧杏仁核上方钻双侧孔，坐标如手稿中所述。使用镊子抓住光纤植入物的套圈，并将套圈固定到立体定位适配器上。
以每分钟两毫米的速度缓慢降低纤维，直到纤维尖端位于LA的背部。将套圈固定在皮肤上，首先使用一层薄薄的乐泰瞬干胶，然后使用牙科水泥。牙科水泥充分干燥后，用套套和防尘罩覆盖套圈。外科手术后，单独饲养大鼠，每天用含有每毫升庆大霉素5毫克和每毫升肝素30 USP单位的盐水冲洗导管。
在行为实验开始前24小时，食物将大鼠限制在其自由摄食体重的90%。将大鼠置于操作室中，每天接受一小时的训练，以每毫升可卡因两毫克的自我给药，在固定比例下进行一次强化。在腔室中，让大鼠按压杠杆。
按压指定的主动杠杆会导致可卡因以每公斤剂量 1 毫克的速度输注，并在 10 秒内呈现复合光和音提示。按压指定的非活动控制杆没有程序效果。继续自我给药实验至少10天，直到大鼠连续三天每天至少输注八次。
在第 20 天之前未能达到采集标准，会导致被排除在研究之外。成功满足采集标准后，通过允许大鼠在操作室中自由杠杆按压，对大鼠进行一小时的仪器消光6至10天。每天继续器械消退，直到连续两天平均最多按压 25 次杠杆。
对于长期抑郁症或LTD的光遗传学诱导，通过悬挂在干净的标准啮齿动物外壳笼上方的旋转接头将跳线连接到473纳米蓝色激光二极管。根据操作说明打开激光器，并将激光器连接到脉冲发生器。调整设置，以两微秒，一赫兹的速度给老鼠900个光脉冲。
使用光传感器测量通过跳线的光输出，并调整激光强度，使通过跳线的光输出约为五到七毫瓦。将大鼠放入干净的外壳笼中，取下露出套圈的防尘罩和套圈套。然后将跳线双向连接到每个套圈。
如果设置得当，啮齿动物将能够在光遗传学刺激期间在笼子周围自由移动。让大鼠探索环境三分钟后，打开脉冲发生器以启动光遗传学刺激。在长期抑郁诱导后，让大鼠在笼子里停留三分钟，然后再把它放回笼子里。
体内光遗传学刺激24小时后，将大鼠放回操作性调节室进行一小时的标准提示诱导恢复会议，以评估可卡因寻求行为。按下主动控制杆会导致 10 秒的灯光和色调提示显示。第一次测试后至少一周，进行第二次恢复测试，以确定光遗传学LTD诱导是否导致可卡因寻求的长期抑制。
在代表性分析中，显示了可卡因自我给药的获取和灭绝。可卡因输注和主动杠杆反应在整个采集过程中增加，几乎没有非活性杠杆反应。在可卡因自我给药期间，每个采集日的积极反应数量逐渐增加，然后在第二周稳定下来。
在灭绝的第一天，观察到杠杆按压的最初增加，随后两个杠杆的反应都下降。在仪器灭绝后，重新引入线索恢复了可卡因寻找，表现为主动杠杆反应数量的增加。光学有限公司导致主动杠杆压力机相对于控制装置的显着减少。
七天后，再次对大鼠进行测试。与对照组相比，以前接受MGN-LA LTD的动物显着减少了主动杠杆按压，这表明光学LTD产生了可卡因寻找的长期减少。离体电生理记录显示，在光学LTD之后，LA神经元中光学诱发的兴奋性突触后电流的振幅降低。
此外，兴奋性突触后电位的上升斜率通过来自假刺激的动物的神经元中的离体光刺激降低，但在具有体内光学LTD的动物的神经元中没有降低。光纤植入物的放置和病毒表达在侧杏仁核和MGN中进行了组织学验证。为了成功减少可卡因的寻找行为，通过光纤植入物实现适当的光输出，并使用持续的低频刺激来促进长期抑郁至关重要。
在此过程之后，神经记录技术可用于确定神经活动的变化，并且可以进行可卡因搜索或其他学习行为的其他行为测试。
