Questo protocollo è significativo perché utilizza nuovi progressi nelle tecniche optogenetiche e un modello preclinico di abuso di sostanze per invertire la plasticità nei circuiti neurali che sono responsabili della promozione della ricaduta. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la manipolazione specifica del circuito dell'attività sinaptica in un animale sveglio, che ha effetti inibitori di lunga durata sul futuro comportamento di ricerca della cocaina motivato dal segnale. Questo metodo potrebbe essere utilizzato in molti altri sistemi e circuiti per manipolare specificamente la neuroplasticità rilevante dal punto di vista comportamentale.
Iniziare a prepararsi per l'intervento chirurgico collegando una cannula per iniezione in acciaio inossidabile calibro 26 a una siringa Hamilton riempita con un microlitro di soluzione concentrata di AAV. Dopo aver anestetizzato l'animale, radere l'area chirurgica e lubrificare gli occhi per evitare l'essiccazione come descritto nel manoscritto testuale. Quindi, iniettare nel ratto un volume corporeo del carprofen analgesico per via sottocutanea attraverso la pelle della parte superiore della schiena e iniettare cinque millilitri di soluzione di Ringer lattato per via sottocutanea attraverso la pelle della parte bassa della schiena.
Quindi eseguire l'impianto del catetere endovenoso. Immediatamente dopo l'impianto del catetere, fissare il ratto in un frame stereotassico per eseguire iniezioni virali adeno-associate. Iniettare un bolo di lidocaina per via sottocutanea attraverso la pelle sopra il cranio per anestetizzare localmente l'area, quindi fare un'incisione di 0,5 millimetri dalla parte anteriore a quella posteriore del cranio.
Rimuovere il tessuto sovrastante per esporre la superficie del cranio. Livellare la testa del topo lungo l'asse posteriore anteriore e zero coordinate stereotassiche al bregma, quindi utilizzare uno strumento dremel dotato di una piccola punta da trapano per praticare tre piccoli fori attraverso il cranio e montare viti in acciaio inossidabile in posizione con un cacciavite. Per l'iniezione di AAV, praticare fori bilaterali in base alle coordinate del Rat Brain Atlas" per il nucleo genicolato mediale o MGN.
Le coordinate utilizzate rispetto al bregma sono meno 5,4 millimetri sull'asse posteriore anteriore, più tre millimetri sull'asse laterale mediale e meno 6,6 millimetri sull'asse ventrale dorsale. Abbassare lentamente la cannula di iniezione a circa quattro millimetri al minuto, fino a quando la cannula non è posizionata correttamente nel MGN, e iniettare la soluzione concentrata di AAV ad una velocità di 0,1 microlitri al minuto. Al termine delle infusioni, lasciare la cannula iniettabile in posizione per cinque minuti per consentire la diffusione del virus lontano dalla cannula e quindi ritirare lentamente la cannula dal cervello.
Successivamente, procedere all'impianto di fibre ottiche mirate ai terminali laterali dell'amigdala del nucleo genicolato mediale. Utilizzare uno strumento dremel per praticare fori bilaterali sopra l'amigdala laterale, alle coordinate come spiegato nel manoscritto. Utilizzare una pinza per afferrare la ghiera dell'impianto in fibra ottica e fissare la ghiera agli adattatori stereotassici in posizione.
Abbassare lentamente le fibre ad una velocità di due millimetri al minuto fino a quando la punta della fibra si trova nella porzione dorsale del LA. Fissare le ghiere sulla pelle, prima utilizzando un sottile strato di adesivo istantaneo Loctite, seguito dal cemento dentale. Una volta che il cemento dentale si è sufficientemente asciugato, coprire le ghiere con manicotti di ghiera e coperchi antipolvere. Dopo le procedure chirurgiche, ospitare il ratto individualmente e lavare i cateteri ogni giorno con soluzione salina contenente cinque milligrammi per millilitro di gentamicina e 30 unità USP per millilitro di eparina.
24 ore prima dell'inizio degli esperimenti comportamentali, il cibo limita i ratti al 90% del loro peso alimentare libero. Mettere il ratto in una camera operante per sottoporsi a sessioni di allenamento giornaliere di un'ora per l'autosomministrazione di due milligrammi per millilitro di cocaina, sotto un rapporto fisso un programma di rinforzo. Nella camera, consentire al topo di premere a leva.
Una pressione sulla leva attiva designata provoca un'infusione di cocaina a un milligrammo per dose di chilogrammo e una presentazione di dieci secondi di un segnale luminoso e tonale composto. Una pressione sulla leva inattiva designata non ha effetti programmati. Continuare gli esperimenti di auto-somministrazione per almeno 10 giorni, fino a quando il ratto guadagna con successo almeno otto infusioni al giorno per tre giorni consecutivi.
Il mancato raggiungimento dei criteri di acquisizione entro il giorno 20 comporta l'esclusione dallo studio. Dopo che i criteri di acquisizione sono stati soddisfatti con successo, sottoporre il ratto a sessioni di estinzione strumentale di un'ora per sei-10 giorni consentendo ai ratti di premere liberamente nelle camere operanti. Continuare l'estinzione strumentale ogni giorno fino a quando non si verifica una media di massimo 25 presse a leva per due giorni consecutivi.
Per l'induzione optogenetica della depressione a lungo termine o LTD, collegare cavi patch a un diodo laser blu da 473 nanometri tramite un giunto rotante sospeso sopra una gabbia di alloggiamento per roditori pulita e standard. Accendere il laser secondo le istruzioni per l'uso e collegarlo a un generatore di impulsi. Regola le impostazioni per dare al topo i 900 impulsi di luce a due microsecondi, a un hertz.
Misurare l'emissione luminosa attraverso il cavo patch utilizzando un sensore di luce e regolare l'intensità del laser in modo che l'emissione luminosa attraverso il cavo patch sia di circa cinque o sette milliwatt. Posizionare il topo nella gabbia dell'alloggiamento pulito e rimuovere i coperchi antipolvere e i manicotti di ghiera che espongono le ghiere. Quindi collegare i cavi patch bilateralmente a ciascuna ghiera.
Se impostati correttamente, i roditori saranno in grado di muoversi liberamente intorno alla gabbia durante la stimolazione optogenetica. Dopo aver permesso al ratto di esplorare l'ambiente per tre minuti, accendere il generatore di impulsi per avviare la stimolazione optogenetica. Dopo l'induzione della depressione a lungo termine, lasciare che il ratto rimanga nella gabbia per tre minuti, prima di rimetterlo nella gabbia di casa.
24 ore dopo la stimolazione optogenetica in vivo, rimettere il ratto nelle camere di condizionamento operante per sottoporsi a una sessione di reintegrazione indotta da segnali standard di un'ora per valutare il comportamento di ricerca della cocaina. Una pressione sulla leva attiva produce una presentazione di dieci secondi della luce e del segnale acustico. Almeno una settimana dopo il primo test, eseguire un secondo test di reintegrazione per determinare se l'induzione optogenetica LTD si traduce in una soppressione a lungo termine della ricerca di cocaina.
Nell'analisi rappresentativa, vengono mostrate l'acquisizione e l'estinzione dell'autosomministrazione di cocaina. Le infusioni di cocaina e le risposte attive della leva sono aumentate durante l'acquisizione, con poche risposte inattive della leva. Durante l'autosomministrazione di cocaina, il numero di risposte attive è aumentato gradualmente in ogni giorno di acquisizione prima di stabilizzarsi durante la seconda settimana.
Il primo giorno dell'estinzione è stato osservato un aumento iniziale nella pressione della leva, seguito da una diminuzione della risposta su entrambe le leve. A seguito dell'estinzione strumentale, la reintroduzione dei segnali ha reintegrato la ricerca di cocaina rappresentata da un aumento del numero di risposte attive della leva. Optical LTD ha causato una significativa riduzione delle pressioni a leva attive rispetto ai comandi.
Sette giorni dopo, i ratti sono stati testati di nuovo. Gli animali precedentemente sottoposti a MGN-LA LTD avevano significativamente ridotto la pressione attiva della leva rispetto ai controlli, rivelando che l'ottica LTD produceva una diminuzione a lungo termine della ricerca di cocaina. Le registrazioni elettrofisiologiche ex vivo hanno mostrato una diminuzione dell'ampiezza della corrente postsinaptica eccitatoria evocata otticamente nei neuroni LA, dopo LTD ottico.
Inoltre, la pendenza ascendente dei potenziali postsinaptici eccitatori è stata ridotta dalla stimolazione ottica ex vivo nei neuroni, da animali che hanno avuto stimolazione fittizia, ma non nei neuroni da animali che avevano LTD ottico in vivo. Il posizionamento di impianti di fibre ottiche e l'espressione virale sono stati verificati istologicamente nell'amigdala laterale e MGN. Per ridurre con successo il comportamento di ricerca della cocaina, è fondamentale ottenere una corretta emissione luminosa attraverso gli impianti di fibre ottiche e utilizzare la stimolazione sostenuta a bassa frequenza per promuovere la depressione a lungo termine.
Seguendo questa procedura, le tecniche di registrazione neurale potrebbero essere utilizzate per determinare i cambiamenti nell'attività neurale e potrebbero essere condotti altri test comportamentali di ricerca di cocaina o altri comportamenti appresi.
