Este protocolo es significativo porque utiliza nuevos avances en técnicas optogenéticas y un modelo preclínico de abuso de sustancias para revertir la plasticidad en los circuitos neuronales que son responsables de promover la recaída. La principal ventaja de esta técnica es que permite la manipulación específica del circuito de la actividad sináptica en un animal despierto, lo que tiene efectos inhibitorios duraderos en el comportamiento futuro de búsqueda de cocaína motivado por señales. Este método podría utilizarse en muchos otros sistemas y circuitos para manipular específicamente la neuroplasticidad conductualmente relevante.
Comience a prepararse para la cirugía conectando una cánula de inyección de acero inoxidable calibre 26 a una jeringa Hamilton llena con un microlitro de solución AAV concentrada. Después de anestesiar al animal, afeite el área quirúrgica y lubrique los ojos para evitar que se sequen como se describe en el texto manuscrito. A continuación, inyecte en la rata un volumen de peso corporal del analgésico carprofeno por vía subcutánea a través de la piel de la parte superior de la espalda e inyecte cinco mililitros de solución de Ringer lactato por vía subcutánea a través de la piel de la espalda baja.
Luego realice la implantación del catéter intravenoso. Inmediatamente después de la implantación del catéter, asegure a la rata en un marco estereotáxico para realizar inyecciones virales adenoasociadas. Inyecte un bolo de lidocaína por vía subcutánea a través de la piel por encima del cráneo para anestesiar localmente el área, y luego haga una incisión de 0,5 milímetros desde la parte frontal hacia la parte posterior del cráneo.
Retire el tejido suprayacente para exponer la superficie del cráneo. Nivele la cabeza de la rata a lo largo del eje posterior anterior y cero coordenadas estereotáxicas a bregma, luego use una herramienta dremel equipada con una pequeña broca para perforar tres pequeños agujeros a través del cráneo y monte tornillos de acero inoxidable en su lugar con un destornillador. Para la inyección de AAV, perfore agujeros bilaterales basados en las coordenadas del Atlas Cerebral de Rata "para el núcleo geniculado medial o MGN.
Las coordenadas utilizadas en relación con bregma son menos 5,4 milímetros en el eje posterior anterior, más tres milímetros en el eje lateral medial, y menos 6,6 milímetros en el eje ventral dorsal. Baje lentamente la cánula de inyección a aproximadamente cuatro milímetros por minuto, hasta que la cánula esté colocada correctamente en el MGN, e inyecte la solución concentrada de AAV a una velocidad de 0,1 microlitros por minuto. Después de completar las infusiones, deje la cánula de inyección en su lugar durante cinco minutos para permitir la difusión del virus lejos de la cánula y luego retire lentamente la cánula del cerebro.
A continuación, proceda a la implantación de fibras ópticas dirigidas a los terminales de la amígdala lateral del núcleo geniculado medial. Use una herramienta dremel para perforar agujeros bilaterales por encima de la amígdala lateral, en las coordenadas como se explica en el manuscrito. Use fórceps para agarrar la virola del implante de fibra óptica y asegure la virola a los adaptadores estereotáxicos en su lugar.
Baje lentamente las fibras a una velocidad de dos milímetros por minuto hasta que la punta de la fibra se asiente en la porción dorsal del LA. Asegure las virolas a la piel, primero usando una capa delgada de adhesivo instantáneo Loctite, seguido de cemento dental. Una vez que el cemento dental se haya secado lo suficiente, cubra las virolas con fundas de virola y cubiertas antipolvo. Después de los procedimientos quirúrgicos, aloje a la rata individualmente y enjuague los catéteres diariamente con solución salina que contenga cinco miligramos por mililitro de gentamicina y 30 unidades USP por mililitro de heparina.
24 horas antes del inicio de los experimentos de comportamiento, los alimentos restringen a las ratas al 90% de su peso libre de alimentación. Coloque a la rata en una cámara operante para someterse a sesiones diarias de entrenamiento de una hora para la autoadministración de dos miligramos por mililitro de cocaína, bajo una proporción fija de un programa de refuerzo. En la cámara, permita que la rata presione la palanca.
Una presión en la palanca activa designada da como resultado una infusión de cocaína a un miligramo por kilogramo de dosis, y una presentación de diez segundos de una señal compuesta de luz y tono. Una pulsación en la palanca inactiva designada no tiene efectos programados. Continúe los experimentos de autoadministración durante al menos 10 días, hasta que la rata gane con éxito al menos ocho infusiones por día durante tres días consecutivos.
Si no se alcanzan los criterios de adquisición para el día 20, se excluye del estudio. Después de que los criterios de adquisición se cumplan con éxito, someta a la rata a sesiones de extinción instrumental de una hora durante seis a 10 días permitiendo que las ratas presionen libremente en cámaras operantes. Continúe la extinción instrumental diariamente hasta que se produzca un promedio de un máximo de 25 prensas de palanca durante dos días consecutivos.
Para la inducción optogenética de la depresión a largo plazo o LTD, conecte los cables de conexión a un diodo láser azul de 473 nanómetros a través de una junta giratoria suspendida sobre una jaula de alojamiento de roedores limpia y estándar. Encienda el láser de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento y conecte el láser a un generador de pulsos. Ajuste la configuración para darle a la rata los 900 pulsos de luz a dos microsegundos, a un hercio.
Mida la salida de luz a través del cable de conexión con un sensor de luz y ajuste la intensidad del láser para que la salida de luz a través del cable de conexión sea de aproximadamente cinco a siete milivatios. Coloque la rata en la jaula de alojamiento limpia y retire las cubiertas antipolvo y las mangas de virola que exponen las virolas. Luego conecte los cables de conexión bilateralmente a cada virola.
Si se configuran correctamente, los roedores podrán moverse libremente alrededor de la jaula durante la estimulación optogenética. Después de permitir que la rata explore el entorno durante tres minutos, encienda el generador de pulsos para iniciar la estimulación optogenética. Después de la inducción de depresión a largo plazo, permita que la rata permanezca en la jaula durante tres minutos, antes de volver a colocarla en la jaula de la casa.
24 horas después de la estimulación optogenética in vivo, coloque a la rata de nuevo en las cámaras de acondicionamiento operante para someterse a una sesión de restablecimiento inducida por señales estándar de una hora para evaluar el comportamiento de búsqueda de cocaína. Una pulsación en la palanca activa da como resultado una presentación de diez segundos de la señal de luz y tono. Al menos una semana después de la primera prueba, realice una segunda prueba de restablecimiento para determinar si la inducción optogenética de LTD resulta en una supresión a largo plazo de la búsqueda de cocaína.
En el análisis representativo se muestra la adquisición y extinción de la autoadministración de cocaína. Las infusiones de cocaína y las respuestas de palanca activa aumentaron durante la adquisición, con pocas respuestas de palanca inactivas. Durante la autoadministración de cocaína, el número de respuestas activas aumentó gradualmente a lo largo de cada día de adquisición antes de estabilizarse durante la segunda semana.
En el primer día de la extinción, se observó un aumento inicial en el prensado de la palanca, seguido de una disminución en la respuesta en ambas palancas. Después de la extinción instrumental, la reintroducción de señales restableció la búsqueda de cocaína representada por un aumento en el número de respuestas de palanca activas. Optical LTD causó una reducción significativa en las prensas de palanca activas en relación con los controles.
Siete días después, las ratas fueron probadas nuevamente. Los animales que previamente se sometieron a MGN-LA LTD habían reducido significativamente el prensado activo de la palanca en comparación con los controles, revelando que LTD óptico produjo una disminución a largo plazo en la búsqueda de cocaína. Los registros electrofisiológicos ex vivo mostraron una disminución en la amplitud de la corriente postsináptica excitatoria evocada ópticamente en las neuronas LA, siguiendo LTD óptica.
Además, la pendiente ascendente de los potenciales postsinápticos excitatorios se redujo mediante estimulación óptica ex vivo en las neuronas, de animales que tenían estimulación simulada, pero no en neuronas de animales que tenían LTD óptica in vivo. La colocación de implantes de fibra óptica y la expresión viral se verificaron histológicamente en la amígdala lateral y MGN. Para reducir con éxito el comportamiento de búsqueda de cocaína, es fundamental lograr una salida de luz adecuada a través de los implantes de fibra óptica y utilizar estimulación sostenida de baja frecuencia para promover la depresión a largo plazo.
Después de este procedimiento, se podrían usar técnicas de registro neuronal para determinar cambios en la actividad neuronal, y se podrían realizar otras pruebas de comportamiento de búsqueda de cocaína u otros comportamientos aprendidos.
