هذا البروتوكول مهم لأنه يستخدم تطورات جديدة في تقنيات البصريات الوراثية ونموذج ما قبل السريري لتعاطي المخدرات لعكس اللدونة في الدوائر العصبية المسؤولة عن تعزيز الانتكاس. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتلاعب بالدائرة المحددة للنشاط المشبكي في مستيقظ ، والذي له تأثيرات مثبطة طويلة الأمد على سلوك البحث عن الكوكايين المحفز في المستقبل. يمكن استخدام هذه الطريقة عبر العديد من الأنظمة والدوائر الأخرى لمعالجة المرونة العصبية ذات الصلة سلوكيا على وجه التحديد.
ابدأ التحضير للجراحة عن طريق توصيل قنية حقن من الفولاذ المقاوم للصدأ قياس 26 بحقنة هاملتون مملوءة بميكرولتر واحد من محلول AAV المركز. بعد تخدير الحيوان ، احلق المنطقة الجراحية وقم بتليين العينين لمنع الجفاف كما هو موضح في مخطوطة النص. بعد ذلك ، قم بحقن حجم وزن الجسم في الفئران من الكاربروفين المسكن تحت الجلد من خلال جلد الجزء العلوي من الظهر ، وحقن خمسة ملليلتر من محلول رينغر المرضع تحت الجلد من خلال جلد أسفل الظهر.
ثم إجراء زرع القسطرة في الوريد. مباشرة بعد زرع القسطرة ، قم بتأمين الفئران في إطار مجسم لإجراء الحقن الفيروسية المرتبطة بالغدية. حقن بلعة من يدوكائين تحت الجلد من خلال الجلد فوق الجمجمة من أجل تخدير المنطقة موضعيا ، ثم إجراء شق 0.5 ملليمتر من الأمام إلى الجزء الخلفي من الجمجمة.
قم بإزالة الأنسجة العلوية لكشف سطح الجمجمة. قم بتسوية رأس الجرذ على طول المحور الخلفي الأمامي والإحداثيات المجسمة الصفرية إلى bregma ، ثم استخدم أداة dremel المجهزة بمثقاب صغير لحفر ثلاثة ثقوب صغيرة عبر الجمجمة ، وتركيب مسامير من الفولاذ المقاوم للصدأ في مكانها باستخدام مفك البراغي. لحقن AAV ، قم بحفر ثقوب ثنائية بناء على الإحداثيات من أطلس دماغ الجرذ "للنواة الجنية الإنسية أو MGN.
الإحداثيات المستخدمة بالنسبة إلى bregma هي ناقص 5.4 ملم على المحور الخلفي الأمامي ، بالإضافة إلى ثلاثة ملليمترات على المحور الجانبي الإنسي ، وناقص 6.6 ملم على المحور البطني الظهري. اخفض قنية الحقن ببطء بمعدل أربعة ملليمترات تقريبا في الدقيقة ، حتى يتم وضع القنية بشكل صحيح في MGN ، وحقن محلول AAV المركز بمعدل 0.1 ميكرولتر في الدقيقة. بعد اكتمال الحقن ، اترك قنية الحقن في مكانها لمدة خمس دقائق للسماح بانتشار الفيروس بعيدا عن القنية ثم اسحب الكانيولا ببطء من الدماغ.
بعد ذلك ، انتقل إلى زرع الألياف البصرية التي تستهدف أطراف اللوزة الدماغية الجانبية للنواة الإنسية. استخدم أداة dremel لحفر ثقوب ثنائية فوق اللوزة الجانبية ، عند الإحداثيات كما هو موضح في المخطوطة. استخدم الملقط للإمساك بحلقة غرسة الألياف البصرية وتأمين الطويق إلى المحولات المجسمة في مكانها.
خفض الألياف ببطء بمعدل ملليمترين في الدقيقة حتى يستقر طرف الألياف في الجزء الظهري من LA. قم بتأمين الحلقات على الجلد ، أولا باستخدام طبقة رقيقة من لاصق Loctite الفوري ، متبوعا بأسمنت الأسنان. بمجرد أن يجف الأسمنت السني بشكل كاف ، قم بتغطية الحلقات بأكمام الطويق وأغطية الغبار. بعد العمليات الجراحية ، قم بإيواء الفئران بشكل فردي وشطف القسطرة يوميا بمحلول ملحي يحتوي على خمسة ملليغرام لكل ملليلتر من الجنتاميسين و 30 وحدة USP لكل ملليلتر من الهيبارين.
قبل 24 ساعة من بدء التجارب السلوكية ، يقيد الطعام الفئران بنسبة 90٪ من وزن التغذية الحرة. ضع الجرذ في غرفة عاملة للخضوع لجلسات تدريبية يومية لمدة ساعة واحدة للإدارة الذاتية من ملليغرام لكل ملليلتر من الكوكايين ، تحت نسبة ثابتة جدول واحد من التعزيز. في الغرفة ، اسمح للفأر بالضغط على الرافعة.
يؤدي الضغط على الرافعة النشطة المعينة إلى ضخ الكوكايين بجرعة ملليغرام واحد لكل كيلوغرام ، وعرض تقديمي مدته عشر ثوان لإشارة مركبة خفيفة ونغمة. الضغط على الرافعة غير النشطة المعينة ليس له تأثيرات مبرمجة. استمر في تجارب الإدارة الذاتية لمدة 10 أيام على الأقل ، حتى يكسب الجرذ بنجاح ما لا يقل عن ثماني دفعات يوميا على مدار ثلاثة أيام متتالية.
الفشل في الوصول إلى معايير الاستحواذ بحلول اليوم 20 ، يؤدي إلى الاستبعاد من الدراسة. بعد استيفاء معايير الاستحواذ بنجاح ، قم بإخضاع الجرذ لجلسات انقراض مفيدة لمدة ساعة واحدة لمدة ستة إلى 10 أيام عن طريق السماح للفئران بالضغط بحرية في غرف العمل. استمر في الانقراض الآلي يوميا حتى يحدث متوسط 25 ضغطة رافعة كحد أقصى على مدار يومين متتاليين.
للتحريض البصري الوراثي للاكتئاب طويل المدى أو LTD ، قم بتوصيل كابلات التصحيح بصمام ليزر أزرق 473 نانومتر عبر مفصل دوار معلق فوق قفص إسكان قوارض قياسي نظيف. قم بتشغيل الليزر وفقا لتعليمات التشغيل وقم بتوصيل الليزر بمولد النبض. اضبط الإعدادات لإعطاء الجرذ 900 نبضة من الضوء عند 2 ميكروثانية ، عند هرتز واحد.
قم بقياس خرج الضوء من خلال سلك التصحيح باستخدام مستشعر الضوء ، واضبط شدة الليزر بحيث يكون خرج الضوء عبر كابل التصحيح حوالي خمسة إلى سبعة ملي واط. ضع الجرذ في قفص السكن النظيف وقم بإزالة أغطية الغبار وأكمام الطويق التي تعرض الحلقات. ثم قم بتوصيل أسلاك التصحيح بشكل ثنائي بكل حلقة.
إذا تم إعدادها بشكل صحيح ، فستكون القوارض قادرة على التحرك بحرية حول القفص أثناء التحفيز البصري الوراثي. بعد السماح للفأر باستكشاف البيئة لمدة ثلاث دقائق ، قم بتشغيل مولد النبض لبدء التحفيز البصري الوراثي. بعد تحريض الاكتئاب على المدى الطويل ، اسمح للفأر بالبقاء في القفص لمدة ثلاث دقائق ، قبل إعادته إلى قفص المنزل.
بعد 24 ساعة من التحفيز البصري الوراثي في الجسم الحي ، ضع الجرذ مرة أخرى في غرف التكييف الفعالة للخضوع لجلسة إعادة قياسية مدتها ساعة واحدة لتقييم سلوك البحث عن الكوكايين. ينتج عن الضغط على الرافعة النشطة عرض تقديمي مدته عشر ثوان لإشارة الضوء والنغمة. بعد أسبوع واحد على الأقل من الاختبار الأول ، قم بإجراء اختبار إعادة ثان لتحديد ما إذا كان تحريض OPTOGENETIC LTD يؤدي إلى قمع طويل الأمد للبحث عن الكوكايين.
في التحليل التمثيلي ، يتم عرض اقتناء وانقراض الإدارة الذاتية للكوكايين. زادت دفعات الكوكايين واستجابات الرافعة النشطة عبر عملية الاستحواذ ، مع وجود عدد قليل من استجابات الرافعة غير النشطة. أثناء التعاطي الذاتي للكوكايين ، زاد عدد الاستجابات النشطة تدريجيا عبر كل يوم اقتناء قبل أن يستقر خلال الأسبوع الثاني.
في اليوم الأول من الانقراض ، لوحظ تعزيز أولي في الضغط على الرافعة ، تلاه انخفاض في الاستجابة على كلا الرافعتين. بعد الانقراض الآلي ، أعادت إعادة إدخال الإشارات البحث عن الكوكايين ممثلة بزيادة في عدد استجابات الرافعة النشطة. تسببت Optical LTD في انخفاض كبير في مكابس الرافعة النشطة بالنسبة إلى أدوات التحكم.
بعد سبعة أيام ، تم اختبار الفئران مرة أخرى. الحيوانات التي خضعت سابقا ل MGN-LA LTD قد قللت بشكل كبير من الضغط النشط على الرافعة مقارنة بالضوابط ، مما كشف أن شركة Optical LTD أنتجت انخفاضا طويل الأجل في البحث عن الكوكايين. أظهرت التسجيلات الكهربية خارج الجسم الحي انخفاضا في سعة التيار بعد المشبكي المثير بصريا في الخلايا العصبية في لوس أنجلوس ، بعد LTD البصري.
بالإضافة إلى ذلك ، تم تقليل منحدر ارتفاع إمكانات ما بعد المشبكي المثيرة عن طريق التحفيز البصري خارج الجسم الحي في الخلايا العصبية ، من الحيوانات التي لديها تحفيز زائف ، ولكن ليس في الخلايا العصبية من الحيوانات التي لديها في الجسم الحي البصرية LTD. تم التحقق من وضع غرسات الألياف البصرية والتعبير الفيروسي نسيجيا في اللوزة الجانبية و MGN. للحد بنجاح من سلوك البحث عن الكوكايين ، من الأهمية بمكان تحقيق ناتج ضوئي مناسب من خلال غرسات الألياف البصرية ، واستخدام التحفيز المستمر منخفض التردد لتعزيز الاكتئاب على المدى الطويل.
بعد هذا الإجراء ، يمكن استخدام تقنيات التسجيل العصبي لتحديد التغيرات في النشاط العصبي ، ويمكن إجراء اختبارات سلوكية أخرى للبحث عن الكوكايين أو السلوكيات المكتسبة الأخرى.
