פרוטוקול זה הוא משמעותי מכיוון שהוא משתמש בהתקדמות חדשה בטכניקות אופטוגנטיות ובמודל פרה-קליני של שימוש בסמים כדי להפוך את הפלסטיות במעגלים עצביים האחראים לקידום הישנות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מניפולציה ספציפית של פעילות סינפטית בחיה ערה, שיש לה השפעות מעכבות ארוכות טווח על התנהגות חיפוש קוקאין המונעת על ידי רמזים עתידיים. שיטה זו יכולה לשמש במערכות ומעגלים רבים אחרים כדי לתפעל באופן ספציפי גמישות מוחית רלוונטית מבחינה התנהגותית.
התחל להתכונן לניתוח על ידי חיבור צינורית הזרקת נירוסטה 26 מד למזרק המילטון מלא מיקרוליטר אחד של תמיסת AAV מרוכזת. לאחר הרדמת החיה, יש לגלח את אזור הניתוח ולשמן את העיניים כדי למנוע התייבשות כמתואר בכתב היד. לאחר מכן, להזריק לתוך החולדה נפח משקל גוף של משכך כאבים carprofen תת עורית דרך העור של הגב העליון, ולהזריק חמישה מיליליטר של פתרון רינגר הנקה תת עורית דרך העור של הגב התחתון.
לאחר מכן לבצע את השתלת קטטר תוך ורידי. מיד לאחר השתלת הצנתר, אבטחו את החולדה במסגרת סטריאוטקסית לביצוע זריקות ויראליות הקשורות באדנו. הזריקו בולוס של לידוקאין תת עורית דרך העור שמעל הגולגולת על מנת להרדים את האזור באופן מקומי, ולאחר מכן בצעו חתך של 0.5 מילימטר מהחזית לחלק האחורי של הגולגולת.
הסר רקמה מעל כדי לחשוף את פני הגולגולת. פלסו את ראש החולדה לאורך הציר האחורי הקדמי ואפס קואורדינטות סטריאוטקסיות לברגמה, ואז השתמשו בכלי דרמל המצויד במקדח קטן כדי לקדוח שלושה חורים קטנים דרך הגולגולת, והרכיבו ברגי נירוסטה במקומם באמצעות מברג. להזרקת AAV, יש לקדוח חורים דו-צדדיים המבוססים על הקואורדינטות מאטלס מוח החולדה"עבור גרעין הגניקולאט המדיאלי או MGN.
הקואורדינטות המשמשות ביחס לברגמה הן מינוס 5.4 מילימטרים בציר האחורי הקדמי, ועוד שלושה מילימטרים בציר הלטרלי המדיאלי, ומינוס 6.6 מילימטרים בציר הגחון הגבי. מורידים לאט את צינורית ההזרקה בכארבעה מילימטרים לדקה, עד שהצינורית ממוקמת כראוי ב-MGN, ומזריקים תמיסת AAV מרוכזת בקצב של 0.1 מיקרוליטר לדקה. לאחר השלמת העירויים, השאירו את צינורית ההזרקה במקומה למשך חמש דקות כדי לאפשר דיפוזיה של הנגיף הרחק מהצינורית ואז משכו לאט את הצינורית מהמוח.
לאחר מכן, המשך להשתלת סיבים אופטיים המכוונים למסופי אמיגדלה צידית של גרעין הגניקולאט האמצעי. השתמש בכלי דרמל כדי לקדוח חורים דו-צדדיים מעל האמיגדלה הצידית, בקואורדינטות כפי שמוסבר בכתב היד. השתמש במלקחיים כדי לתפוס את הפרול של שתל הסיב האופטי ולהצמיד את הפרול למתאמים הסטריאוטקסיים במקום.
לאט לאט להוריד סיבים בקצב של שני מילימטרים לדקה עד קצה הסיב יושב בחלק הגבי של LA. הצמידו את השיניים לעור, תחילה באמצעות שכבה דקה של דבק אינסטנט Loctite, ולאחר מכן מלט דנטלי. לאחר שהמלט הדנטלי התייבש מספיק, כסו את הפרולים בשרוולי פרול ובכיסויי אבק. לאחר הליכים כירורגיים, אחסן את החולדה בנפרד ושטוף צנתרים מדי יום במי מלח המכילים חמישה מיליגרם למיליליטר גנטמיצין ו -30 יחידות USP למיליליטר הפרין.
24 שעות לפני תחילת הניסויים ההתנהגותיים, המזון מגביל את החולדות ל-90% ממשקל ההזנה החופשית שלהן. הניחו את החולדה בתא ניתוח כדי לעבור אימונים יומיים של שעה למתן עצמי של שני מיליגרם למיליליטר קוקאין, תחת יחס קבוע של לוח זמנים אחד של חיזוק. בתא, אפשרו לחולדה ללחוץ על המנוף.
לחיצה על המנוף הפעיל הייעודי מביאה לעירוי קוקאין במינון של מיליגרם אחד לקילוגרם, ולהצגה של עשר שניות של רמז מורכב של אור וטון. לחיצה על הידית הלא פעילה הייעודית אינה כוללת אפקטים מתוכנתים. המשיכו בניסויי הניהול העצמי במשך 10 ימים לפחות, עד שהחולדה תשיג בהצלחה לפחות שמונה עירויים ביום במשך שלושה ימים רצופים.
אי הגעה לקריטריונים לרכישה עד היום ה-20, גורמת להדרה מהמחקר. לאחר עמידה מוצלחת בקריטריוני הרכישה, העבירו את החולדה למפגשי הכחדה אינסטרומנטלית של שעה למשך שישה עד 10 ימים, על ידי מתן אפשרות לחולדות ללחוץ בחופשיות בתאי ניתוח. יש להמשיך בהכחדה אינסטרומנטלית מדי יום עד ללחיצה ממוצעת של 25 מנופים במשך יומיים רצופים.
עבור אינדוקציה אופטוגנטית של דיכאון לטווח ארוך או LTD, חבר כבלי תיקון לדיודת לייזר כחולה 473 ננומטר באמצעות מפרק סיבובי התלוי מעל כלוב בית מכרסמים נקי וסטנדרטי. הפעל את הלייזר בהתאם להוראות ההפעלה וחבר את הלייזר למחולל פולסים. התאימו את ההגדרות כדי לתת לחולדה את 900 פולסי האור בשני מיקרו-שניות, בהרץ אחד.
מדוד את תפוקת האור דרך כבל התיקון באמצעות חיישן אור, וכוונן את עוצמת הלייזר כך שתפוקת האור דרך כבל התיקון תהיה כחמישה עד שבעה מילי-וואט. הניחו את החולדה בכלוב הדיור הנקי והסירו את כיסויי האבק ושרוולי הפרול החושפים את הפרולים. לאחר מכן חבר את כבלי התיקון באופן דו-צדדי לכל פרול.
אם יוגדרו כראוי, מכרסמים יוכלו לנוע בחופשיות בכלוב במהלך גירוי אופטוגנטי. לאחר שאפשרתם לחולדה לחקור את הסביבה במשך שלוש דקות, הפעילו את מחולל הדופק כדי ליזום גירוי אופטוגנטי. לאחר השראת דיכאון לטווח ארוך, אפשרו לחולדה להישאר בכלוב במשך שלוש דקות, לפני שתחזירו אותה לכלוב הביתי.
24 שעות לאחר גירוי אופטוגנטי in vivo, החזירו את החולדה לתאי ההתניה האופרנטיים כדי לעבור מפגש החזרה סטנדרטי של שעה כדי להעריך התנהגות המחפשת קוקאין. לחיצה על הידית הפעילה מביאה להצגה של עשר שניות של רמז האור והטון. לפחות שבוע לאחר הבדיקה הראשונה, תן בדיקת השבה שנייה כדי לקבוע אם השראת LTD אופטוגנטית גורמת לדיכוי ארוך טווח של חיפוש קוקאין.
בניתוח המייצג, רכישה והכחדה של ניהול עצמי קוקאין מוצגים. עירויי קוקאין ותגובות מנוף פעיל גדלו במהלך הרכישה, עם מעט תגובות מנוף לא פעילות. במהלך מתן עצמי של קוקאין, מספר התגובות הפעילות גדל בהדרגה בכל יום רכישה לפני שהתייצב במהלך השבוע השני.
ביום הראשון להכחדה נצפתה עלייה ראשונית בלחיצת המנוף, ואחריה ירידה בתגובה בשני המנופים. בעקבות ההכחדה האינסטרומנטלית, החזרה של רמזים החזירה את חיפוש הקוקאין המיוצג על ידי עלייה במספר תגובות המנוף הפעילות. אופטיקל בע"מ גרמה לירידה משמעותית בלחיצות המנוף האקטיביות ביחס לבקרות.
שבעה ימים לאחר מכן, חולדות נבדקו שוב. בעלי חיים שעברו בעבר MGN-LA LTD הפחיתו משמעותית את לחיצת המנוף האקטיבית בהשוואה לבקרות, וחשפו כי אופטיקל בע"מ הביאה לירידה ארוכת טווח בחיפוש קוקאין. רישומים אלקטרופיזיולוגיים Ex vivo הראו ירידה באמפליטודה של זרם פוסט-סינפטי מעורר אופטית בנוירונים בלוס אנג'לס, בעקבות אופטיקה LTD.
בנוסף, שיפוע העלייה של פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מעוררים הופחת על ידי גירוי אופטי ex vivo בנוירונים, מבעלי חיים שהיו להם גירוי דמה, אך לא בתאי עצב מבעלי חיים שהיו להם in vivo optical LTD. המיקום של שתלי סיבים אופטיים וביטוי נגיפי אומתו היסטולוגית באמיגדלה הצידית וב- MGN. כדי להפחית בהצלחה את ההתנהגות המחפשת קוקאין, חיוני להשיג תפוקת אור תקינה באמצעות שתלי הסיב האופטי, ולהשתמש בגירוי מתמשך בתדר נמוך כדי לקדם דיכאון לטווח ארוך.
בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בטכניקות הקלטה עצבית כדי לקבוע שינויים בפעילות העצבית, וניתן לבצע בדיקות התנהגותיות אחרות של חיפוש קוקאין או התנהגויות נלמדות אחרות.
