Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es neuartige Fortschritte in optogenetischen Techniken und ein präklinisches Modell des Drogenmissbrauchs verwendet, um die Plastizität in neuronalen Schaltkreisen umzukehren, die für die Förderung eines Rückfalls verantwortlich sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine schaltungsspezifische Manipulation der synaptischen Aktivität in einem wachen Tier ermöglicht, was eine lang anhaltende hemmende Wirkung auf das zukünftige Kokain-motivierte Kokain-Suchverhalten hat. Diese Methode könnte in vielen anderen Systemen und Schaltkreisen eingesetzt werden, um die verhaltensrelevante Neuroplastizität gezielt zu manipulieren.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung auf die Operation, indem Sie eine 26-Gauge-Injektionskanüle aus Edelstahl an eine Hamilton-Spritze anschließen, die mit einem Mikroliter konzentrierter AAV-Lösung gefüllt ist. Nach der Betäubung des Tieres rasieren Sie den Operationsbereich und schmieren Sie die Augen, um ein Austrocknen zu verhindern, wie im Textmanuskript beschrieben. Als nächstes injizieren Sie der Ratte ein Körpergewichtsvolumen des Analgetikums Carprofen subkutan durch die Haut des oberen Rückens und injizieren Sie fünf Milliliter laktierte Ringer-Lösung subkutan durch die Haut des unteren Rückens.
Führen Sie dann die intravenöse Katheterimplantation durch. Unmittelbar nach der Katheterimplantation wird die Ratte in einem stereotaktischen Rahmen gesichert, um Adeno-assoziierte Virusinjektionen durchzuführen. Injizieren Sie einen Bolus Lidocain subkutan durch die Haut über dem Schädel, um den Bereich lokal zu betäuben, und machen Sie dann einen 0,5-Millimeter-Schnitt von der Vorderseite zur Rückseite des Schädels.
Entfernen Sie darüber liegendes Gewebe, um die Oberfläche des Schädels freizulegen. Nivellieren Sie den Kopf der Ratte entlang der vorderen hinteren Achse und null stereotaktischen Koordinaten zu Bregma, dann verwenden Sie ein Dremel-Werkzeug, das mit einem kleinen Bohrer ausgestattet ist, um drei kleine Löcher durch den Schädel zu bohren, und montieren Sie Edelstahlschrauben mit einem Schraubendreher. Für die Injektion von AAV bohren Sie bilaterale Löcher basierend auf den Koordinaten aus dem Rat Brain Atlas" für den medialen genikulären Kern oder MGN.
Die Koordinaten, die relativ zu Bregma verwendet werden, sind minus 5,4 Millimeter auf der vorderen hinteren Achse, plus drei Millimeter auf der medialen lateralen Achse und minus 6,6 Millimeter auf der dorsalen ventralen Achse. Senken Sie die Injektionskanüle langsam mit etwa vier Millimetern pro Minute ab, bis die Kanüle richtig im MGN positioniert ist, und injizieren Sie konzentrierte AAV-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 0,1 Mikrolitern pro Minute. Nachdem die Infusionen abgeschlossen sind, lassen Sie die Injektionskanüle fünf Minuten lang an Ort und Stelle, um die Diffusion des Virus von der Kanüle weg zu ermöglichen, und ziehen Sie dann die Kanüle langsam aus dem Gehirn heraus.
Als nächstes fahren Sie mit der Implantation von optischen Fasern fort, die auf den medialen genikulären Kern der lateralen Amygdala-Terminals abzielen. Verwenden Sie ein Dremel-Werkzeug, um bilaterale Löcher über der lateralen Amygdala zu bohren, an Koordinaten, wie im Manuskript erklärt. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Ferrule des Glasfaserimplantats zu greifen und die Ferrule an den stereotaktischen Adaptern zu befestigen.
Senken Sie die Fasern langsam mit einer Geschwindigkeit von zwei Millimetern pro Minute, bis die Spitze der Faser im dorsalen Teil des LA sitzt. Befestigen Sie die Aderendhülsen auf der Haut, zuerst mit einer dünnen Schicht Loctite-Sofortkleber, gefolgt von Zahnzement. Sobald der Zahnzement ausreichend getrocknet ist, decken Sie die Aderendhülsen mit Zwingenhülsen und Staubabdeckungen ab. Nach chirurgischen Eingriffen sollte die Ratte einzeln untergebracht und täglich mit Kochsalzlösung gespült werden, die fünf Milligramm pro Milliliter Gentamicin und 30 USP-Einheiten pro Milliliter Heparin enthält.
24 Stunden vor Beginn von Verhaltensexperimenten beschränken Lebensmittel Ratten auf 90% ihres freien Futtergewichts. Legen Sie die Ratte in eine operante Kammer, um sich täglich einstündigen Trainingseinheiten für die Selbstverabreichung von zwei Milligramm pro Milliliter Kokain zu unterziehen, unter einem festen Verhältnis zu einem Verstärkungsplan. Lassen Sie die Ratte in der Kammer hebeln.
Ein Druck auf den dafür vorgesehenen aktiven Hebel führt zu einer Kokaininfusion mit einem Milligramm pro Kilogramm Dosis und einer zehnsekündigen Präsentation eines zusammengesetzten Licht- und Tonsignals. Ein Druck auf den dafür vorgesehenen inaktiven Hebel hat keine programmierten Effekte. Setzen Sie die Selbstverabreichungsexperimente für mindestens 10 Tage fort, bis die Ratte mindestens acht Infusionen pro Tag an drei aufeinanderfolgenden Tagen erfolgreich verdient hat.
Das Nichterreichen der Akquisitionskriterien bis zum 20. Tag führt zum Ausschluss von der Studie. Nachdem die Aufnahmekriterien erfolgreich erfüllt sind, unterziehen Sie die Ratte sechs bis 10 Tage lang einer einstündigen instrumentellen Extinktionssitzung, indem Sie den Ratten erlauben, in operanten Kammern frei zu drücken. Setzen Sie die instrumentelle Extinktion täglich fort, bis durchschnittlich maximal 25 Hebeldrücke an zwei aufeinanderfolgenden Tagen auftreten.
Für die optogenetische Induktion von Langzeitdepression oder LTD verbinden Sie Patchkabel mit einer blauen 473-Nanometer-Laserdiode über ein Drehgelenk, das über einem sauberen Standard-Nagetiergehäusekäfig hängt. Schalten Sie den Laser gemäß Bedienungsanleitung ein und schließen Sie den Laser an einen Pulsgenerator an. Passen Sie die Einstellungen an, um der Ratte die 900 Lichtimpulse in zwei Mikrosekunden mit einem Hertz zu geben.
Messen Sie die Lichtleistung durch das Patchkabel mit einem Lichtsensor und stellen Sie die Laserintensität so ein, dass die Lichtleistung durch das Patchkabel etwa fünf bis sieben Milliwatt beträgt. Setzen Sie die Ratte in den sauberen Käfig und entfernen Sie Staubschutzabdeckungen und Aderendhülsen, die die Aderendhülsen freilegen. Verbinden Sie dann die Patchkabel bilateral mit jeder Ferrule.
Bei richtiger Einrichtung können sich Nagetiere während der optogenetischen Stimulation frei im Käfig bewegen. Nachdem Sie der Ratte drei Minuten lang erlaubt haben, die Umgebung zu erkunden, schalten Sie den Pulsgenerator ein, um die optogenetische Stimulation einzuleiten. Lassen Sie die Ratte nach der Induktion einer langfristigen Depression drei Minuten im Käfig verbleiben, bevor Sie sie wieder in den heimischen Käfig legen.
24 Stunden nach der optogenetischen In-vivo-Stimulation legen Sie die Ratte zurück in die operanten Konditionierungskammern, um sich einer einstündigen Standard-Cue-induzierten Wiedereinsetzungssitzung zu unterziehen, um das Kokainsuchverhalten zu beurteilen. Ein Druck auf den aktiven Hebel führt zu einer zehnsekündigen Darstellung des Licht- und Tonsignals. Führen Sie mindestens eine Woche nach dem ersten Test einen zweiten Wiedereinsetzungstest durch, um festzustellen, ob die optogenetische LTD-Induktion zu einer langfristigen Unterdrückung der Kokainsuche führt.
In der repräsentativen Analyse werden Erwerb und Extinktion der Kokain-Selbstverabreichung gezeigt. Kokaininfusionen und aktive Hebelreaktionen nahmen während des Erwerbs zu, mit wenigen inaktiven Hebelreaktionen. Während der Selbstverabreichung von Kokain nahm die Anzahl der aktiven Reaktionen an jedem Akquisitionstag allmählich zu, bevor sie sich in der zweiten Woche stabilisierte.
Am ersten Tag des Aussterbens wurde ein anfänglicher Anstieg des Hebeldrückens beobachtet, gefolgt von einer Abnahme der Reaktion auf beide Hebel. Nach dem instrumentellen Aussterben stellte die Wiedereinführung von Hinweisen die Kokainsuche wieder her, was sich in einer Zunahme der Anzahl aktiver Hebelreaktionen niederschlug. Optical LTD bewirkte eine signifikante Reduzierung der aktiven Hebelpressen im Vergleich zu den Steuerungen.
Sieben Tage später wurden Ratten erneut getestet. Tiere, die zuvor einer MGN-LA LTD unterzogen wurden, hatten im Vergleich zu den Kontrollen das aktive Hebeldrücken signifikant reduziert, was zeigte, dass optische LTD zu einer langfristigen Verringerung der Kokainsuche führte. Ex vivo elektrophysiologische Aufzeichnungen zeigten eine Abnahme der Amplitude des optisch evozierten exzitatorischen postsynaptischen Stroms in LA-Neuronen nach optischer LTD.
Zusätzlich wurde die Anstiegssteigung der exzitatorischen postsynaptischen Potentiale durch ex vivo optische Stimulation in den Neuronen von Tieren mit Scheinstimulation reduziert, nicht jedoch in Neuronen von Tieren, die in vivo optische LTD hatten. Die Platzierung von Glasfaserimplantaten und die virale Expression wurden histologisch in der lateralen Amygdala und MGN verifiziert. Um das Kokain-Suchverhalten erfolgreich zu reduzieren, ist es wichtig, eine angemessene Lichtleistung durch die Glasfaserimplantate zu erzielen und eine anhaltende, niederfrequente Stimulation zu verwenden, um langfristige Depressionen zu fördern.
Im Anschluss an dieses Verfahren könnten neuronale Aufzeichnungstechniken verwendet werden, um Veränderungen der neuronalen Aktivität zu bestimmen, und andere Verhaltenstests der Kokainsuche oder anderer erlernter Verhaltensweisen könnten durchgeführt werden.
