Bu protokol önemlidir, çünkü optogenetik tekniklerdeki yeni ilerlemeleri ve nüksetmeyi teşvik etmekten sorumlu nöral devrelerdeki plastisiteyi tersine çevirmek için klinik öncesi bir madde bağımlılığı modeli kullanır. Bu tekniğin temel avantajı, uyanık bir hayvanda sinaptik aktivitenin devreye özgü manipülasyonuna izin vermesidir, bu da gelecekteki ipucu motivasyonlu kokain arama davranışı üzerinde uzun süreli inhibitör etkilere sahiptir. Bu yöntem, davranışsal olarak ilgili nöroplastisiteyi özel olarak manipüle etmek için diğer birçok sistem ve devrede kullanılabilir.
26 gauge paslanmaz çelik enjeksiyon kanülünü bir mikrolitre konsantre AAV çözeltisi ile doldurulmuş bir Hamilton şırıngasına bağlayarak ameliyat için hazırlanmaya başlayın. Hayvanı uyuşturduktan sonra, cerrahi bölgeyi tıraş edin ve metin yazısında açıklandığı gibi kurumayı önlemek için gözleri yağlayın. Daha sonra, sıçana analjezik karprofenin vücut ağırlığı hacmini deri altından üst sırtın derisinden enjekte edin ve alt sırtın derisinden deri altından beş mililitre laktasyonlu Ringer çözeltisi enjekte edin.
Daha sonra intravenöz kateter implantasyonunu gerçekleştirin. Kateter implantasyonunu hemen takiben, adeno ile ilişkili viral enjeksiyonları gerçekleştirmek için stereotaksik bir çerçevede sıçanı sabitleyin. Bölgeyi lokal olarak anestezik hale getirmek için kafatasının üstündeki deriden deri altından bir lidokain bolusu enjekte edin ve ardından kafatasının önünden arkasına 0,5 milimetrelik bir kesi yapın.
Kafatasının yüzeyini ortaya çıkarmak için üstteki dokuyu çıkarın. Sıçanın kafasını ön arka eksen boyunca düzleştirin ve sıfır stereotaksik koordinatları bregmaya düzleştirin, ardından kafatasından üç küçük delik açmak için küçük bir matkap ucu ile donatılmış bir dremel aleti kullanın ve paslanmaz çelik vidaları bir tornavida ile yerine monte edin. AAV enjeksiyonu için, medial genikülat çekirdeği veya MGN için Sıçan Beyin Atlası'ndaki koordinatlara dayanarak iki taraflı delikler açın.
Bregmaya göre kullanılan koordinatlar ön arka eksende eksi 5.4 milimetre, artı medial lateral eksende üç milimetre ve dorsal ventral eksende eksi 6.6 milimetredir. Kanül MGN'ye düzgün bir şekilde yerleştirilene kadar enjeksiyon kanülünü dakikada yaklaşık dört milimetrede yavaşça indirin ve konsantre AAV çözeltisini dakikada 0.1 mikrolitre oranında enjekte edin. İnfüzyonlar tamamlandıktan sonra, virüsün kanülden uzağa yayılmasına izin vermek için enjeksiyon kanülünü beş dakika boyunca yerinde bırakın ve ardından kanülü beyinden yavaşça çekin.
Daha sonra, medial genikülat çekirdek lateral amigdala terminallerini hedef alan optik liflerin implantasyonuna geçin. Yanal amigdalanın üstünde, makalede açıklandığı gibi koordinatlarda iki taraflı delikler açmak için bir dremel aleti kullanın. Optik fiber implantın yüksüğünü kavramak için forseps kullanın ve yüksüğü stereotaksik adaptörlere sabitleyin.
Liflerin ucu LA'nın dorsal kısmına oturana kadar lifleri dakikada iki milimetre oranında yavaşça indirin. Yüksükleri cilde sabitleyin, önce ince bir Loctite anında yapıştırıcı tabakası kullanarak, ardından diş çimentosu kullanın. Diş çimentosu yeterince kuruduktan sonra, yüksükleri yüksük manşonları ve toz örtüleri ile örtün. Cerrahi prosedürleri takiben, sıçanı ayrı ayrı barındırın ve kateterleri günlük olarak mililitre gentamisin başına beş miligram ve mililitre heparin başına 30 USP birimi içeren salin ile yıkayın.
Davranışsal deneylerin başlamasından 24 saat önce, yiyecekler sıçanları serbest beslenme ağırlıklarının% 90'ı ile sınırlar. Sıçanı, mililitre kokain başına iki miligramın kendi kendine uygulanması için günlük bir saatlik eğitim seanslarına tabi tutulması için bir çalışma odasına yerleştirin, sabit bir oran altında bir takviye programı. Odada, sıçanın kol basmasına izin verin.
Belirlenen aktif kol üzerindeki bir baskı, kilogram dozu başına bir miligramda kokain infüzyonu ve bileşik bir ışık ve ton ipucunun on saniyelik bir sunumu ile sonuçlanır. Belirlenen etkin olmayan kol üzerindeki bir presin programlanmış bir etkisi yoktur. Sıçan art arda üç gün boyunca günde en az sekiz infüzyonu başarılı bir şekilde kazanana kadar en az 10 gün boyunca kendi kendine yönetim deneylerine devam edin.
20. güne kadar edinme kriterlerine ulaşılamaması, çalışmadan dışlanma ile sonuçlanır. Edinme kriterleri başarıyla karşılandıktan sonra, sıçanların çalışma odalarında serbestçe basmalarına izin vererek sıçanı altı ila 10 gün boyunca bir saatlik enstrümantal yok olma seanslarına tabi tutun. Üst üste iki gün boyunca ortalama maksimum 25 kollu pres gerçekleşene kadar enstrümantal yok oluşa günlük olarak devam edin.
Uzun süreli depresyon veya LTD'nin optogenetik indüksiyonu için, yama kablolarını temiz, standart bir kemirgen barınak kafesinin üzerinde asılı duran döner bir eklem aracılığıyla 473 nanometre mavi lazer diyota bağlayın. Lazeri kullanım talimatlarına göre açın ve lazeri bir darbe jeneratörüne bağlayın. Sıçana iki mikrosaniyede, bir hertz'de 900 ışık darbesi vermek için ayarları yapın.
Bir ışık sensörü kullanarak yama kablosundan ışık çıkışını ölçün ve lazer yoğunluğunu, yama kablosundan geçen ışık çıkışı yaklaşık beş ila yedi miliwatt olacak şekilde ayarlayın. Sıçanı temiz muhafaza kafesine yerleştirin ve yüksükleri açığa çıkaran toz kapaklarını ve yüksük manşonlarını çıkarın. Ardından yama kablolarını her bir yüksüğe iki taraflı olarak bağlayın.
Düzgün bir şekilde kurulursa, kemirgenler optogenetik stimülasyon sırasında kafesin etrafında serbestçe hareket edebileceklerdir. Sıçanın çevreyi üç dakika boyunca keşfetmesine izin verdikten sonra, optogenetik stimülasyonu başlatmak için nabız jeneratörünü açın. Uzun süreli depresyon indüksiyonunu takiben, sıçanın ev kafesine geri yerleştirmeden önce üç dakika kafeste kalmasına izin verin.
İn vivo optogenetik stimülasyondan 24 saat sonra, kokain arama davranışını değerlendirmek için bir saatlik standart ipucu kaynaklı eski haline getirme oturumundan geçmek için sıçanı tekrar operant koşullandırma odalarına yerleştirin. Aktif kola basıldığında, ışık ve ton işaretinin on saniyelik bir sunumu yapılır. İlk testten en az bir hafta sonra, optogenetik LTD indüksiyonunun kokain arayışının uzun süreli baskılanmasıyla sonuçlanıp sonuçlanmadığını belirlemek için ikinci bir eski haline getirme testi yapın.
Temsili analizde, kokainin kendi kendini yönetmesinin edinilmesi ve yok edilmesi gösterilmiştir. Kokain infüzyonları ve aktif kol yanıtları, az sayıda inaktif kol yanıtı ile edinim boyunca artmıştır. Kokainin kendi kendini yönetmesi sırasında, aktif yanıtların sayısı, ikinci hafta boyunca stabilize edilmeden önce her edinim günü boyunca kademeli olarak artmıştır.
Neslinin tükenmesinin ilk gününde ve kol preslemede ilk artış gözlendi, ardından her iki kolda da yanıt vermede bir azalma oldu. Araçsal yok oluşun ardından, ipuçlarının yeniden tanıtılması, aktif kol yanıtlarının sayısındaki artışla temsil edilen kokain arayışını yeniden başlattı. Optik LTD, kontrollere göre aktif kollu preslerde önemli bir azalmaya neden olmuştur.
Yedi gün sonra, sıçanlar tekrar test edildi. Daha önce MGN-LA LTD'ye maruz kalan hayvanlar, kontrollere kıyasla aktif kol preslemesini önemli ölçüde azaltmış ve optik LTD'nin kokain aramada uzun vadeli bir düşüş sağladığını ortaya koymuştur. Ex vivo elektrofizyolojik kayıtlar, optik LTD'yi takiben LA nöronlarında optik olarak uyarılmış uyarıcı postsinaptik akımın genliğinde bir azalma olduğunu göstermiştir.
Ek olarak, uyarıcı postsinaptik potansiyellerin yükselme eğimi, nöronlarda, sahte stimülasyonu olan hayvanlardan ex vivo optik stimülasyon ile azaltıldı, ancak in vivo optik LTD olan hayvanlardan gelen nöronlarda değil. Lateral amigdala ve MGN'de optik fiber implantların yerleştirilmesi ve viral ekspresyon histolojik olarak doğrulandı. Kokain arama davranışını başarılı bir şekilde azaltmak için, optik fiber implantlar aracılığıyla uygun ışık çıkışı elde etmek ve uzun süreli depresyonu teşvik etmek için sürekli, düşük frekanslı stimülasyon kullanmak çok önemlidir.
Bu prosedürü takiben, nöral aktivitedeki değişiklikleri belirlemek için nöral kayıt teknikleri kullanılabilir ve kokain arama veya diğer öğrenilmiş davranışların diğer davranışsal testleri yapılabilir.
