Este protocolo é significativo porque utiliza novos avanços em técnicas optogenéticas e um modelo pré-clínico de abuso de substâncias para reverter a plasticidade em circuitos neurais que são responsáveis por promover a recaída. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a manipulação específica do circuito da atividade sináptica em um animal acordado, o que tem efeitos inibitórios duradouros sobre o comportamento de busca de cocaína motivado por pistas futuras. Este método poderia ser utilizado em muitos outros sistemas e circuitos para manipular especificamente a neuroplasticidade comportamentalmente relevante.
Comece a se preparar para a cirurgia conectando uma cânula de injeção de aço inoxidável de calibre 26 a uma seringa Hamilton preenchida com um microlitro de solução concentrada de AAV. Após anestesiar o animal, raspe a área cirúrgica e lubrifique os olhos para evitar o ressecamento, conforme descrito no manuscrito do texto. Em seguida, injete no rato um volume de peso corporal do analgésico carprofeno por via subcutânea através da pele da parte superior das costas e injete cinco mililitros de solução de Ringer lactato por via subcutânea através da pele da parte inferior das costas.
Em seguida, realize o implante de cateter intravenoso. Imediatamente após o implante do cateter, prenda o rato em uma estrutura estereotáxica para realizar injeções virais adenoassociadas. Injete um bolus de lidocaína por via subcutânea através da pele acima do crânio, a fim de anestesiar localmente a área e, em seguida, faça uma incisão de 0,5 milímetros da frente para a parte traseira do crânio.
Remova o tecido sobrejacente para expor a superfície do crânio. Nivele a cabeça do rato ao longo do eixo posterior anterior e zero coordenadas estereotáxicas para bregma, em seguida, use uma ferramenta dremel equipada com uma pequena broca para perfurar três pequenos orifícios através do crânio e monte parafusos de aço inoxidável no lugar com uma chave de fenda. Para a injeção de AAV, faça furos bilaterais com base nas coordenadas do Atlas do Cérebro de Rato "para o núcleo geniculado medial ou MGN.
As coordenadas utilizadas em relação ao bregma são menos 5,4 milímetros no eixo anterior posterior, mais três milímetros no eixo lateral medial e menos 6,6 milímetros no eixo ventral dorsal. Abaixe lentamente a cânula de injeção a aproximadamente quatro milímetros por minuto, até que a cânula esteja devidamente posicionada no MGN e injete a solução concentrada de AAV a uma taxa de 0,1 microlitros por minuto. Após a conclusão das perfusões, deixe a cânula de injeção no lugar durante cinco minutos para permitir a difusão do vírus para longe da cânula e, em seguida, retire lentamente a cânula do cérebro.
Em seguida, proceda ao implante de fibras ópticas visando os terminais laterais da amígdala lateral do núcleo geniculado medial. Use uma ferramenta de dremel para perfurar furos bilaterais acima da amígdala lateral, em coordenadas como explicado no manuscrito. Use fórceps para agarrar a ponteira do implante de fibra óptica e prenda a ponteira aos adaptadores estereotáxicos no lugar.
Abaixe lentamente as fibras a uma taxa de dois milímetros por minuto até que a ponta da fibra fique na porção dorsal do AL. Fixe ferrules à pele, primeiro usando uma fina camada de adesivo instantâneo Lotitite, seguido de cimento dental. Uma vez que o cimento dentário tenha secado o suficiente, cubra as ferrules com mangas de ferrule e capas de poeira. Após os procedimentos cirúrgicos, alojar o rato individualmente e lavar os cateteres diariamente com solução salina contendo cinco miligramas por mililitro de gentamicina e 30 unidades USP por mililitro de heparina.
24 horas antes do início dos experimentos comportamentais, os alimentos restringem os ratos a 90% de seu peso de alimentação livre. Coloque o rato em uma câmara operante para se submeter a sessões diárias de treinamento de uma hora para autoadministração de dois miligramas por mililitro de cocaína, sob uma proporção fixa de um cronograma de reforço. Na câmara, permita que o rato lever pressione.
Uma prensagem na alavanca ativa designada resulta em uma infusão de cocaína a um miligrama por quilograma de dose e uma apresentação de dez segundos de uma sugestão composta de luz e tom. Uma pressão na alavanca inativa designada não tem efeitos programados. Continue os experimentos de autoadministração por pelo menos 10 dias, até que o rato ganhe com sucesso pelo menos oito infusões por dia durante três dias consecutivos.
O não cumprimento dos critérios de aquisição até o dia 20, resulta na exclusão do estudo. Após o cumprimento bem-sucedido dos critérios de aquisição, submeta o rato a sessões instrumentais de extinção de uma hora por seis a 10 dias, permitindo que os ratos lever livremente a prensa em câmaras operantes. Continue a extinção instrumental diariamente até que ocorra uma média de no máximo 25 pressões de alavanca durante dois dias consecutivos.
Para a indução optogenética da depressão a longo prazo ou LTD, conecte os cabos de remendo a um diodo laser azul de 473 nanômetros através de uma junta rotativa suspensa acima de uma gaiola de alojamento de roedores limpa e padrão. Ligue o laser de acordo com as instruções de operação e conecte o laser a um gerador de pulsos. Ajuste as configurações para dar ao rato os 900 pulsos de luz a dois microssegundos, a um hertz.
Meça a saída de luz através do patch cord usando um sensor de luz e ajuste a intensidade do laser para que a saída de luz através do patch cable seja de aproximadamente cinco a sete miliwatts. Coloque o rato na gaiola de alojamento limpa e remova as tampas de poeira e as mangas de ferrule expondo as ferrules. Em seguida, conecte os cabos de remendo bilateralmente a cada ferrule.
Se configurado corretamente, os roedores poderão se mover livremente ao redor da gaiola durante a estimulação optogenética. Depois de permitir que o rato explore o ambiente por três minutos, ligue o gerador de pulso para iniciar a estimulação optogenética. Após a indução da depressão a longo prazo, permita que o rato permaneça na gaiola por três minutos, antes de colocá-lo de volta na gaiola doméstica.
24 horas após a estimulação optogenética in vivo, coloque o rato de volta nas câmaras de condicionamento operante para se submeter a uma sessão de reintegração induzida por uma sugestão padrão de uma hora para avaliar o comportamento de busca de cocaína. Uma pressão na alavanca ativa resulta em uma apresentação de dez segundos da luz e do tom de sinalização. Pelo menos uma semana após o primeiro teste, faça um segundo teste de reintegração para determinar se a indução optogenética de LTD resulta em uma supressão a longo prazo da busca de cocaína.
Na análise representativa, mostra-se a aquisição e extinção da autoadministração de cocaína. As infusões de cocaína e as respostas ativas da alavanca aumentaram ao longo da aquisição, com poucas respostas de alavanca inativas. Durante a autoadministração de cocaína, o número de respostas ativas aumentou gradualmente em cada dia de aquisição antes de se estabilizar durante a segunda semana.
No primeiro dia da extinção, observou-se um aumento inicial na pressão da alavanca, seguido por uma diminuição na resposta em ambas as alavancas. Após a extinção instrumental, a reintrodução de pistas restabeleceu a busca de cocaína representada por um aumento no número de respostas ativas de alavanca. O LTD óptico causou uma redução significativa nas prensas de alavanca ativas em relação aos controles.
Sete dias depois, os ratos foram testados novamente. Os animais que foram submetidos anteriormente à MGN-LA LTD reduziram significativamente a pressão ativa da alavanca em comparação com os controles, revelando que o LTD óptico produziu uma diminuição a longo prazo na busca de cocaína. Registros eletrofisiológicos ex vivo mostraram uma diminuição na amplitude da corrente pós-sináptica excitatória evocada opticamente em neurônios do AE, seguindo a LTD óptica.
Além disso, a inclinação ascendente dos potenciais pós-sinápticos excitatórios foi reduzida pela estimulação óptica ex vivo nos neurônios, de animais que tiveram estimulação simulada, mas não em neurônios de animais que tinham LTD óptica in vivo. A colocação de implantes de fibra óptica e a expressão viral foram verificadas histologicamente na amígdala lateral e MGN. Para reduzir com sucesso o comportamento de busca de cocaína, é fundamental alcançar a saída de luz adequada através dos implantes de fibra óptica e usar estimulação sustentada de baixa frequência para promover a depressão a longo prazo.
Após esse procedimento, técnicas de registro neural poderiam ser usadas para determinar mudanças na atividade neural, e outros testes comportamentais de busca de cocaína ou outros comportamentos aprendidos poderiam ser realizados.
