Этот протокол важен, потому что он использует новые достижения в оптогенетических методах и доклиническую модель злоупотребления психоактивными веществами, чтобы обратить вспять пластичность в нейронных цепях, которые отвечают за содействие рецидиву. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет специфическую схему манипулирования синаптической активностью у бодрствующего животного, что оказывает длительное тормозное воздействие на будущее поведение, мотивированное кокаином. Этот метод может быть использован во многих других системах и схемах для конкретного манипулирования поведенчески значимой нейропластичностью.
Начните подготовку к операции, подключив инъекционную канюлю из нержавеющей стали 26 калибра к шприцу Гамильтона, заполненному одним микролитром концентрированного раствора AAV. После обезболивания животного побрейте хирургическую область и смажьте глаза, чтобы предотвратить высыхание, как описано в тексте рукописи. Далее вводят крысе объем массы тела анальгетика карпрофена подкожно через кожу верхней части спины, а также вводят пять миллилитров лактированного раствора Рингера подкожно через кожу нижней части спины.
Затем выполняют внутривенную имплантацию катетера. Сразу после имплантации катетера закрепите крысу в стереотаксической рамке для выполнения аденоассоциированных вирусных инъекций. Вводят болюс лидокаина подкожно через кожу над черепом, чтобы локально обезболить область, а затем делают 0,5-миллиметровый разрез от передней до задней части черепа.
Удалите вышележащую ткань, чтобы обнажить поверхность черепа. Выровняйте голову крысы вдоль передней задней оси и нулевые стереотаксические координаты до брегмы, затем используйте инструмент дремеля, оснащенный небольшим сверлом, чтобы просверлить три небольших отверстия через череп, и установите винты из нержавеющей стали на место с помощью отвертки. Для инъекции AAV просверлите двусторонние отверстия на основе координат из Атласа мозга крысы для медиального геникулярного ядра или MGN.
Координаты, используемые относительно брегмы, составляют минус 5,4 миллиметра на передней задней оси, плюс три миллиметра на медиальной боковой оси и минус 6,6 миллиметра на дорсальной вентральной оси. Медленно опустите канюлю для инъекций примерно на четыре миллиметра в минуту, пока канюли не будут правильно расположены в MGN, и вводите концентрированный раствор AAV со скоростью 0,1 микролитра в минуту. После того, как инфузии будут завершены, оставьте инъекционную канюлю на месте в течение пяти минут, чтобы обеспечить диффузию вируса от канюли, а затем медленно выведите канюлю из мозга.
Далее приступаем к имплантации оптических волокон, нацеленных на медиальное геникулярное ядро боковых терминалей миндалины. Используйте инструмент дремеля, чтобы просверлить двусторонние отверстия над боковой миндалевидной телом, в координатах, как описано в рукописи. Используйте щипцы, чтобы захватить наконечник имплантата оптического волокна и закрепить наконечник на стереотаксических адаптерах на месте.
Медленно опускайте волокна со скоростью два миллиметра в минуту, пока кончик волокна не сядет в дорсальную часть LA. Прикрепите наконечники к коже, сначала используя тонкий слой мгновенного клея Loctite, а затем зубной цемент. После того, как зубной цемент достаточно высохнет, накройте наконечники рукавами и пылезащитными крышками. После хирургических процедур поместите крысу индивидуально и ежедневно промывайте катетеры физиологическим раствором, содержащим пять миллиграммов на миллилитр гентамицина и 30 единиц USP на миллилитр гепарина.
За 24 часа до начала поведенческих экспериментов пища ограничивает крыс до 90% их свободного кормового веса. Поместите крысу в оперантную камеру, чтобы она проходила ежедневные часовые тренировки по самостоятельному введению двух миллиграммов на миллилитр кокаина, при фиксированном соотношении одного графика подкрепления. В камере дайте крысе нажать на рычаг.
Нажатие на назначенный активный рычаг приводит к инфузии кокаина в дозу один миллиграмм на килограмм и десятисекундному представлению сложного светового и тонального сигнала. Нажатие на назначенный неактивный рычаг не имеет запрограммированных эффектов. Продолжайте эксперименты по самостоятельному введению в течение не менее 10 дней, пока крыса успешно не заработает не менее восьми инфузий в день в течение трех последовательных дней.
Неспособность достичь критериев приобретения к 20-му дню приводит к исключению из исследования. После того, как критерии приобретения успешно выполнены, подвергайте крысу одночасовым сеансам инструментального вымирания в течение шести-10 дней, позволяя крысам свободно нажимать в оперантных камерах. Продолжайте инструментальное вымирание ежедневно до тех пор, пока в среднем не произойдет максимум 25 рычажных нажатий в течение двух последовательных дней.
Для оптогенетической индукции длительной депрессии или LTD подключите патч-кабели к 473-нанометровому синему лазерному диоду через поворотный шарнир, подвешенный над чистой, стандартной клеткой для грызунов. Включите лазер в соответствии с инструкциями по эксплуатации и подключите лазер к генератору импульсов. Отрегулируйте настройки, чтобы дать крысе 900 импульсов света в две микросекунды, в один герц.
Измерьте светоотдачу через патч-корд с помощью датчика освещенности и отрегулируйте интенсивность лазера таким образом, чтобы светоотдача через патч-кабель составляла примерно пять-семь милливатт. Поместите крысу в чистую клетку корпуса и снимите пылезащитные крышки и рукава наконечников, обнажающие наконечники. Затем подключите патч-корды двусторонне к каждому наконечнику.
При правильной настройке грызуны смогут свободно передвигаться по клетке во время оптогенетической стимуляции. Позволив крысе исследовать окружающую среду в течение трех минут, включите генератор импульсов, чтобы инициировать оптогенетическую стимуляцию. После длительной индукции депрессии дайте крысе оставаться в клетке в течение трех минут, прежде чем поместить ее обратно в домашнюю клетку.
Через 24 часа после оптогенетической стимуляции in vivo поместите крысу обратно в камеры оперантного кондиционирования, чтобы пройти одночасовой стандартный сеанс восстановления, вызванный сигналом, для оценки поведения, ищущего кокаин. Нажатие на активный рычаг приводит к десятисекундному представлению светового и тонального сигнала. По крайней мере, через неделю после первого теста дайте второй тест на восстановление, чтобы определить, приводит ли оптогенетическая индукция LTD к долгосрочному подавлению поиска кокаина.
В репрезентативном анализе показано приобретение и угасание самоприменения кокаина. Инфузии кокаина и активные рычажные реакции увеличивались по мере приобретения, с небольшим количеством неактивных реакций рычага. Во время самостоятельного приема кокаина количество активных реакций постепенно увеличивалось в течение каждого дня приобретения, прежде чем стабилизироваться в течение второй недели.
В первый день вымирания наблюдалось первоначальное усиление нажатия на рычаг, за которым последовало снижение реакции на оба рычага. После инструментального вымирания реинтродукция сигналов восстановила поиск кокаина, что выражается в увеличении числа активных рычажных реакций. Optical LTD вызвала значительное снижение активных рычажных прессов относительно органов управления.
Семь дней спустя крысы были снова протестированы. Животные, которые ранее подвергались MGN-LA LTD, значительно снизили активное нажатие рычага по сравнению с контрольной группой, показав, что оптический LTD произвел долгосрочное снижение поиска кокаина. Электрофизиологические записи ex vivo показали снижение амплитуды оптически вызванного возбуждающего постсинаптического тока в нейронах LA, вслед за оптическим LTD.
Кроме того, наклон подъема возбуждающих постсинаптических потенциалов был уменьшен путем оптической стимуляции ex vivo в нейронах у животных, у которых была фиктивная стимуляция, но не у нейронов животных, которые имели in vivo оптический LTD. Размещение имплантатов оптических волокон и вирусная экспрессия были проверены гистологически в боковой миндалине и MGN. Чтобы успешно уменьшить поведение, связанное с поиском кокаина, крайне важно достичь надлежащей светоотдачи через имплантаты оптического волокна и использовать устойчивую низкочастотную стимуляцию для содействия долгосрочной депрессии.
Следуя этой процедуре, методы нейронной записи могут быть использованы для определения изменений в нейронной активности, и могут быть проведены другие поведенческие тесты поиска кокаина или другого приобретенного поведения.
