A interferência de RNA é uma das principais ferramentas utilizadas para a genética reversa em mosquitos e a entrega oral nos permite induzir e manter o silenciamento genético em mosquitos adultos sem a necessidade de micro injeção. A entrega oral de RNA de dois fios para mosquitos adultos é um método de interferência de RNA de baixo custo e versátil que reduz significativamente o trabalho e o tempo e o esforço para estudar a função genética. Este método poderia ser usado para estudar não apenas outros genes-alvo em Anopheles gambiae, mas também em outros anofelinos de interesse, como Anopheles albinamus.
Para começar, crie uma cultura a partir de uma única colônia bacteriana de Escherichia coli strain HT115(DE3)contendo o RNA duplo encalhado expressando plasmídeo em cinco mililitros de lb contendo ampicillina e tetraciclina em um agitador de plataforma por 12 horas a 37 graus Celsius e 180 RPM. Após 12 horas, pegue 0,5 mililitros da cultura bacteriana cultivada durante a noite e faça uma diluição em 1000 em mídia de triptonina de levedura 2X contendo ampicillina e tetraciclina. Para induzir a produção de RNA duplamente encalhada, adicione IPDG na concentração final de 40 micromolar.
Em seguida, incubar a cultura por duas horas em condições de agitação, como demonstrado. No final da incubação, quando a densidade óptica da cultura atinge 0,4 a 600 nanômetros, pelota as células bacterianas por centrificação a 4.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius e depois lave as células em um volume de PBS. Depois de girar as células mais uma vez, resuspensar as células em PBS e incubar a 70 graus Celsius por uma hora.
Após o calor matando as bactérias, faça alíquotas de 400 microliter volume e armazene-as a 20 graus Celsius até usar mais. Misture uma alíquota de 400 microliteres de calor degelo que matou bactérias expressando RNA duplamente encalhado com 1,6 mililitros de solução de 12% de açúcar contendo 0,2% de metilparaben. Mergulhe uma pequena bola de algodão nesta solução e coloque-a dentro de uma gaiola contendo mosquitos de cinco dias de idade e garanta que os mosquitos se alimentem dessa solução.
Troque a bola de algodão encharcada em solução de açúcar RNA de dois fios a cada dois dias por oito dias consecutivos, garantindo que a gaiola seja mantida em condições constantes. Para anestesiar os mosquitos com frio, coloque o recipiente no gelo até que os mosquitos parem de se mover e, em seguida, coloque os mosquitos em uma superfície fria para isolar as fêmeas para dissecção. Depois de pulverizar os mosquitos com etanol, coloque-os em uma superfície de vidro com PBS.
Com um par de fórceps, proteja a cabeça do mosquito e puxe o tórax muito lentamente permitindo que as glândulas salivares sejam liberadas na PBS. Uma vez que as glândulas salivares são dissecadas a partir de 10 mosquitos, puxe as glândulas para extração de RNA. Após a conclusão da extração de RNA, suspenda a pelota de RNA em 30 microliters de água livre RNAs.
Meça a absorvência e calcule a concentração de RNA conforme descrito no manuscrito do texto. Usando um kit de transcrição reversa comercial, sintetize cDNA de um micrograma de RNA. Diluir o cDNA 10 vezes e configurar as reações rtpcr em triplicados para genes de alvo e limpeza de acordo com as recomendações do fabricante.
Amplie o CDNA com condições padrão de PCR em tempo real. Para avaliar a capacidade de alimentação sanguínea, coloque grupos de 15 mosquitos fêmeas tratados com RNA alvo e controlado duplo encalhado em gaiolas pequenas e os esfuja por quatro horas. Forneça sangue barato desfibrilado aos mosquitos usando um banho de água circulante a 37 graus Celsius, alimentadores de mosquitos de vidro e membrana perisífila.
Observe, conte e regise o número de tentativas de sondagem para adquirir com sucesso uma refeição sanguínea das cinco primeiras fêmeas para se tornar totalmente engorgado em cada grupo. Depois de isolar tecido fresco e PBS já demonstrou anteriormente, fixá-lo em acetona gelada por 90 segundos. Em seguida, enxágue o tecido várias vezes em PBS e incubar com anticorpos primários durante a noite a quatro graus Celsius com antissoro diluído em PBS.
No final da incubação, lave o tecido várias vezes com PBS. Adicione anticorpos secundários fluorescentes diluídos em PBS e incubar no escuro à temperatura ambiente por duas horas. Adicione qualquer mancha de contador 30 minutos antes do fim da incubação de duas horas.
Depois de duas horas, lave o tecido três vezes com PBS, depois monte os tecidos em 100% glicerol em um slide de microscópio padrão com um deslizamento de cobertura de um milímetro de espessura e armazene a 20 graus Celsius até a imagem. Os dados de expressão de micro aray mostraram a expressão de todos os genes alvo escolhidos em glândulas salivares adultas e os níveis de AAPP e sálvia foram particularmente elevados. O RNA duplo encalhado efetivamente reduziu a abundância de transcrições da cabeça de garfo na glândula salivar.
A cabeça de garfo duplamente encalhada RNA alimentado mosquitos exibiu cinco vezes mais tentativas de alimentação do que o grupo controle ou FEG duplo sexo duplo RNA alimentado mosquitos para ser completamente engorgado com sangue. Os níveis de sálvia e coloração de CrebA foram significativamente reduzidos em todos os lóbulos da glândula salivar após a interferência do RNA da cabeça de garfo em comparação com a interferência do RNA de controle de formigas. Ao considerar proteínas componentes de saliva altamente abundantes, os níveis de AAPP foram reduzidos em todos os três lóbulos da glândula salivar após a interferência do RNA da cabeça de garfo em comparação com o tratamento de interferência de RNA.
Por outro lado, não foram observadas alterações nos níveis de mucina. Esses dados sugerem que a cabeça de garfo contribui de forma diferente para a expressão de diferentes genes de proteína saliva. A fluorescência rab11 reduzida foi observada em lóbulos laterais distais após o tratamento de interferência do RNA da cabeça de garfo, no entanto, também ocorreu o aumento do sinal rab11 nos lobos laterais medial e proximal.
Não foi observada diferença perceptível no sinal vermelho do Nilo após a interferência do RNA do cabeça de garfo em comparação com o tratamento de interferência de RNA de controle. alguma reação secretária máquina de uma maneira complexa que difere entre lóbulos da glândula salivar. Essa técnica poderia permitir que os pesquisadores silenciassem genes para os quais a expressão pode ser reduzida por uma única injeção de RNA de dois fios e explorar a entrega oral do RNA de dois fios para usar rnai como um método potencial de controle vetorial.
